魔芋种芋组织培养繁育技术规程.DOC

1、DB42/T 2010ICSX DB42湖 北 省 地 方 标 准魔芋组培良种繁育技术规程Technical rules for Tissue culture konjac super seed crom propagation201-发布 201-实施湖北省质量技术监督局 发布/T前 言本标准附录A是规范性附录。本标准由湖北省农业农业厅提出并归口。本标准起草单位：湖北省恩施土家族苗族自治州农业科学院、湖北省农科院、华中科技大学、武汉大学、西南大学。本标准主要起草人：陈永波、顾玉成、余龙江、胡中立、张盛林、滕建勋、郭光耀、赵青华、降巧龙。/T引 言魔芋组培良种繁育技术近年来在魔芋种植产业中逐步

2、得到推广应用，极大地提高了魔芋种芋的产量和品质，加速了魔芋组培良种繁育体系的建设。为了规范魔芋组培良种的繁育和供应体系，实现魔芋组培良种繁供的标准化，特制订本标准。本标准在制订过程中，参考了许多国内相关技术资料，结合了国内多家单位的科研和生产情况，其操作的规范化，体现了我国魔芋组培良种生产和供应的技术水平。魔芋组培良种繁育技术规程1、范围本标准规定了魔芋试管苗、原原种、原种、良种繁育的术语及定义、繁殖体系、繁殖技术、采收、分级、运输和贮藏。本标准适用于组织培养的魔芋种芋繁殖。2、规范性及引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。原有条款中与本标准不一致的内容，以本标准为主。在

3、本标准发布后改进的内容，可作为对本版本的修订；如果内容改动较大，可作为新版本发布。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。NY/T715-2003 魔芋种芋繁殖技术规程DB42/T 332-2005 魔芋丰产栽培技术操作规程DB61/T382-2006 魔芋种子繁育种芋分级标准3、术语及定义 下列术语和定义适用于本标准。3.1 外植体 explant由具有本品种特征的活植物体上分离下来以进行培养的组织或器官（如魔芋的球茎、根状茎、叶片、叶柄、芽孢、生长点等的切块、细胞、原生质体等）的各种接种材料。3.2 愈伤组织 callus将外植体放在适当的培养基上进行培养，器官或组织进行细胞分裂，

4、形成的新组织（薄壁细胞团）。3.3 试管苗 test-tube plant 外植体在适合的光照、温度和营养元素、激素等条件下，经愈伤组织分化或其它途径，产生出各种器官和组织，进而发育成具有本品种特征的完整魔芋植株。3.4 原原种 super seed crom 由试管苗在光照、温度、营养元素元素等因素可控的条件下（试管内或非试管）栽培，倒苗后形成的具有本品种特征的魔芋球茎或根状茎，包括试管芋和非试管芋。3.4.1 试管芋 test-tube crom试管苗栽培在试管内，倒苗后形成的球茎。3.4.1 非试管芋 de-test tube crom试管苗出瓶后栽培在温度、光照、营养元素等条件可控的温

5、、网室等试管外（如营养液栽培），倒苗后形成的球茎。3.5 原种 basic seed crom原原种扩繁的球茎或根状茎。3.6 良种 elite seed crom 原种扩繁的球茎或根状茎。4 繁育体系及要求4.1 繁育体系魔芋外植体试管苗原原种原种良种。4.2 繁育要求4.2.1 试管苗 有试管苗工厂化生产车间，包括药品室、制剂室、洗涤室、接种室和组培室，有专业技术人员操作。 4.2.2 原原种有工厂化生产车间，包括组培室或温室、网室，具备温、光、营养元素等试管苗形成原原种过程中可控的环境条件，试管芋生产在组培室进行，营养液栽培在温、网室进行，有专业技术人员操作。 4.2.3 原种要求有一定

6、规模的网室或大棚，栽培介质要求疏松透气，可采用草炭+蛭石+珍珠岩作基质或火土、腐植土、壤土等，有专业技术人员操作。4.2.4 良种 将原种挖收后，进行分级、包装，运往种芋生产基地种植，成熟后即为商品芋的种芋，有魔芋种植经验的人员指导。5 繁殖方法5.1 试管苗5.1.1 外植体取样部位及取样时期魔芋球茎和根状茎在3月-6月顶芽萌动未出苗之前，叶柄和叶片在幼叶未展开之前，其它外植体取样时间均应选取样部位生长旺盛时期。5.1.2 外植体消毒、灭菌 魔芋球茎和根状茎在密闭的容器中用甲醛-高锰酸钾熏蒸20min30min后取出，待福尔马林气味散尽后75%酒精、0.1%升汞进行表面灭菌；叶柄、叶片、芽胞

7、等外植体只需用75%酒精、0.1%升汞进行表面消毒灭菌后，用灭菌水洗净；从试管中培养的丛生芽中剥取的茎尖、芽鞘等顶端分生组织不需消毒灭菌。5.1.3 培养基采用MS培养基，添加不同的激素，配方与制作方法见附录A（规范性附录）。5.1.4 接种 将消毒灭菌的魔芋球茎或根状茎在无菌环境下横向切成约10 mm10 mm5 mm的小块，叶片切成约10 mm10 mm的小块，叶柄切成约10 mm长的小段，接种在培养基中，每瓶接种1块（段）。5.1.5 培养 在清洁、干燥、通风并经环境消毒的培养室内，温度2526，相对湿度65%70%条件下，培养30d35d，可见外植体膨大35倍，形成愈伤组织。培养过程中

8、，每7d10d观察一次，及时清除污染。5.1.6 扩繁（继代培养） 在无菌环境下将愈伤组织取出，切成约8 mm8 mm 的小块，转入继代培养基中，每瓶接种23块，放入培养室继续培养。5.1.7 诱导分化 母苗（愈伤组织）扩繁到一定数量后，将愈伤组织取出，每块切34块，转入分化培养基，诱导丛生芽。5.1.8 试管苗 将丛生芽分割成单株，带少量愈伤组织，移入分化培养基中，诱导生根和出苗，形成完整植株。5.2 原原种5.2.1 繁殖方法5.2.1.1 试管内栽培试管苗接种到生根培养基中，在温度2526，相对湿度65%70%，光照20000Lux左右的培养室中生长50d80d，在瓶内倒苗，基部膨大，形

9、成原原种。5.2.1.2 营养液栽培试管苗基部长出0.5 cm-2.0 cm的根后，带少量愈伤组织切下，用小流量自来水轻轻冲洗掉基部的培养基， 在25左右、相对湿度65%70%、自然光照条件下，温内炼苗7-10d。在温、网室内进行营养液栽培，倒苗后形成原原种。5.2.2 采收和贮藏5.2.2.1 采收将成熟的原原种摘下，洗去培养基，在日光下晾晒1-2d或置于通风透气处晾干水分。5.2.2.2 贮藏将采收的原原种贮藏于河沙或其它基质中，以防失水过多，越冬时要采取措施，避免冻伤。5.3 原种5.3.1 催芽原原种播种前，用1%的硫脲浸泡1h，取出晾干，置于泥炭、河沙等基质中，保持湿度80%90%，

10、温度2025条件下催芽2530d。5.3.2 播种 在平整的栽培介质（基质、火土、腐植土、壤土等）上掏出810cm深的小沟，沟间距15cm，亩施1520kg复合肥作底肥，覆介质12cm，将出芽的原原种顶芽向上摆放，间距10cm，覆平基质，浇水使基质或土壤保持湿润。5.3.3 管理原原种出苗后至魔芋成熟期前，喷施1% K2HPO4溶液或其它叶面肥 2-3 次，施复合肥 1-2 次。 网室或大棚内温度要保持在13 -30 以内，土壤湿度低于 60%， 空气湿度低于 80% 就应浇水。发现虫害可用敌杀死进行杀虫；若发现病株，立即将全株带土取出地外进行烧毁或深埋，同时用 1000 万单位农用链霉素兑水

11、 4000倍液灌穴（软腐病），或在穴内及周围撒生石灰（白绢病），及时控制，防止漫延，在进入 6 月份后，用农用链霉素每隔7 d打一次，连续打3 次，以防软腐病、叶枯病等病害的发生；生长期要及时拔除杂草，拔草时应注意防止损伤幼苗。 5.3.4 采收倒苗10d后即可采挖，球茎及其根状茎不能受伤，晾晒5 h后除净泥土，剔除病、虫害球茎，转移到遮雨、通风处继续风干待贮。5.4 良种5.4.1 繁育由原种在良种繁育基地生产，繁殖技术参照NY/T715-2003（魔芋种芋繁殖技术规程）和DB42/T 3322005（魔芋丰产栽培技术操作规程）5.4.2 分级及质量要求级别一级二级三级质 量 (g)50-1

12、0010-5010 发芽率(%)989692 纯 度(%)100100100感 观 表皮褐色或淡黄色，无病、无伤、无霉烂。5.4.3 包装、标志5.4.3.1 包装魔芋良种宜装在已消毒、硬质抗压、透气的专用箱筐，包装规格为15kg/箱30kg/箱。5.4.3.2 标志包装箱上应标注：产品名称、类别、等级、净含量、生产企业（或销售企业）名称和地址、生产日期、保质期。5.4.4 运输5.4.4.1 产品在运输、装卸时应小心轻放，严禁撞击、挤压和雨淋。5.4.4.2 一级良种直接运输到商品芋生产基地栽培，二级、三级原原种运输到商品种芋生产基地栽培。5.4.5 贮藏种芋贮藏在温度5-10，空气相对湿度

13、60-80%，通风透气。 附录A （规范性附录） MS培养基的配制 A.1 MS培养基母液的制备A.1.1 贮备液：大量元素，包括N、P、K、Ca、Mg等五种元素，其化合物成分和用量如下： 成分数量(mg/L)成分数量(mg/L)NH4NO316,500MgSO4.7H2O3 700KNO319 000KH2PO41 700CaCl2.2H2O4 400 配制方法：先分别称取以上数量的药品于100mL-500mL的烧杯中，分别加适量蒸馏水或纯净水溶解，其中NH4NO3和KNO3溶解时需吸热，冬季配制时可适当加温，MgSO4.7H2O难以溶解时可适当加温或加几滴1N的HCl溶液（如果仍不溶解，可

14、能是因药品变质所导致，需弃去不用，另换新购买的药品），待所有药品都完全溶解后，转入装有约400mL蒸馏水的1L容量瓶中，边转边摇动容量瓶，使溶液稀释，以免发生沉淀。所有装溶液的烧杯均需用蒸馏水洗涤3-4次，洗液一并转入容量瓶。最后，用蒸馏水定容至刻度。有时一次需配制大量母液（如10L、20L甚至更多），可将各种溶液分别定容至1L或2L，转入装有约1/4蒸馏水的容器中，将定容的溶液分别倒入该容器，每倒入一种溶液将容器摇动或搅拌，使其混合均匀，所有溶液均倒入该容器后，再用容量瓶添加不足的蒸馏水到需配置的容积后，充分混合均匀。采用该法需注意的是一定要记清每次添加溶液的数量。母液配好后，要在试剂瓶上贴

15、上标签，写明“MS大量元素、配制日期、配制人”等。使用时，每配制1L培养基用量筒量取100mL该贮备液。A.1.2 贮备液：微量元素，包括Cu、Zn、Mn、Mo、B、I、Co等七种元素，其化合物成分和用量如下： 成分数量(mg/L)成分数量(mg/L)KI166Na2MoO4.2H2O50H3BO31 240CuSO4.5H2O5MnSO4.7H2O4 460CoCl2.6H2O5ZnSO4.7H2O1 720配制方法：先分别称取以上数量的药品于50mL-150mL的烧杯中（对于称量少于1000mg的微量元素，需用1/10000的电子分析天平，否则不容易称量准确），分别加适量蒸馏水或纯净水溶解

16、，按大量元素一样的操作步骤定容到1L后，转入1L棕色试剂瓶中，贴上标签，保存在低温冰箱中，使用时每1L培养基吸取5mL该贮备液。A.1.3 贮备液：铁盐，现一般用EDTA络合铁，能够适应pH5-8的培养物吸收，其化合物成分及其用量如下：成分数量(mg/L)成分数量(mg/L)FeSO4.7H2O5 560Na2.EDTA.2H2O7 460配制方法：在1/100的天平上先分别称取以上数量的药品于500mL的烧杯中，加适量蒸馏水，加热并不断搅拌使之溶解，然后将两种溶液混合把pH调到5.5，加蒸馏水到最终容积1L，贮备同微量元素。使用时每1L培养基吸取5mL该贮备液。A.1.4 贮备液：有机物，其

17、化合物成分及其用量如下：成分数量(mg/L)成分数量(mg/L)肌醇20 000盐酸硫胺素100烟酸100甘氨酸400盐酸吡哆醇100配制方法：以上试剂分别在1/100的天平上称取后，置于50mL-250mL的烧杯中，加适量蒸馏水溶解后，按大量元素配置方法定容，贮备同微量元素。使用时每1L培养基吸取5mL该贮备液。A.1.5 贮备液：激素 魔芋培养基中常用的激素如下：成分数量(mg/100mL)成分数量(mg/100mL)6-BA1002,4-D100IBA100KT100NAA100GA3100配制方法：2,4-D、NAA、IBA等生长素一般溶于95%酒精或0.1N的NaOH溶液，定容后分别

18、贮存在100mL棕色试剂瓶中，贴上标签，保存在低温冰箱中。6-BA、KT等细胞分裂素一般溶于0.5-1.0N的稀盐酸或0.1N的稀NaOH溶液，贮存方法同生长素。与生长素和细胞分裂素相比，GA3不常使用，但少量使用在打破魔芋球茎的休眠有一定的作用。GA3易溶于冷水，最多配成1000mg/L的溶液，但GA3溶于水后不稳定，容易分解，故最好以95%的酒精配成母液后在冰箱中保存。A.1.6 贮备液：0.1%聚乙烯吡咯烷酮（PVP）+0.5%维生素（Vc）溶液贮备液 分别称取10g PVP和50g Vc溶解于400mL蒸馏水中，混合后定容至1L，制培养基时每升培养基中添加100mL。魔芋初始培养切块时

19、，取贮备液10mL稀释至100mL于培养瓶中（如果使用三角瓶需用封口膜封好），与培养基一同灭菌。A.1.7 无菌水 将蒸馏水或纯净水装在三角瓶、葡萄糖瓶等容器中，用棉塞塞紧或用封口膜扎好，在高压灭菌锅中灭菌30min，即为无菌水。A.1.8 蔗糖 可用市售白糖。A.1.9 琼脂 现一般用琼脂粉，可以不经溶化直接添加到培养瓶中。A.2 魔芋培养基的制备A.2.1 培养基中各种物质的用量 每1000 mL培养基中添加贮备液100mL、贮备液5mL 、贮备液 5mL 、贮备液 5mL、A.1.5中各种激素适量、贮备液 100mL 、蔗糖30 g、琼脂粉5g7g。A.2.2 配制方法 在1000 mL

20、容量瓶中先装上约500 mL蒸馏水，再将各种贮备液分别加到容量瓶中，每加一种溶液后要充分摇匀，以免局部浓度过高产生沉淀，所有物质都添加后，用蒸馏水定容，充分混合后，用0.1N NaOH和0.1N HCl调节培养基pH值至5.86.5。将糖和琼脂加到可加热容器中，加入约70%的混合溶液，在电炉或水浴锅上加热至沸，糖和琼脂完全溶化后，再加入剩余的溶液，用玻棒或小铲充分混合均匀，转入分液器中进行分装，如果分装器是玻璃器皿，注意要待培养基冷却至60左右，温度太高会引起玻璃瓶爆裂。A.2.3 分装 根据培养器皿的大小，每瓶可装培养基25 mL40 mL。在分装过程中，如果培养基开始凝固，则必须重新加热使

21、其溶化，只有培养基在液态的时候才能分装。分装在培养瓶中的培养基需用带透气片的瓶盖或封口膜封严，瓶盖或封口膜能阻止微生物污染，但可使空气自由交换。A.2.4 灭菌 分装的培养基必须及时灭菌，夏天一般不能放置过夜，否则会很快变质。把已装入培养基并封盖好培养瓶放在高压灭菌锅中，在121(1.06kg/cm2或0.15MPa) 下灭菌15min20min。培养基灭菌的同时，接种操作用的蒸馏水、培养皿、剪刀、镊子、刀片、烧杯等在超净工作台上使用的一起用具也必须用牛皮纸包好后放入高压灭菌锅中灭菌，但灭菌时间一般需增加到25-30min，如果与培养基一同灭菌，时间过长会影响培养基的效果，因此，需要分开灭菌。A.2.5保存 灭菌后的培养基在室温下冷却后，需要接种的部分可放置在超净工作台上，其余部分最好放在4冰箱中保存。12