《银杏叶黄酮的提取研究》.doc

1、目 录摘要1关键词1引言11材料与方法211 试验材料2111 银杏叶2112 试剂2113 仪器212 试验方法 2121标准曲线的制备 2122银杏叶总黄酮提取率计算方法 2123银杏叶总黄酮的提取工艺 2124单因素试验 3125正交试验 32结果与分析321标准曲线 322单因素试验分析最佳酶解条件4221酶解温度的确定 4222酶浓度的确定 5223酶解时间的确定 523最佳提取条件的确定 63讨论64结论 7致谢7参考文献7英文摘要8摘要：本旨在对银杏叶黄酮的提取工艺进行优化以及探讨最佳提取条件，试验以纤维素酶液，弱碱性乙醇溶液为提取液，采用酶解醇提相结合的方法，并与传统的单独酶解

2、和单独醇提相对照，研究不同的酶解因素对银杏叶中黄酮提取率的影响。试验中对酶解温度，纤维素酶液浓度。酶解时间做了单因素试验，并在此基础上做了正交试验，找出了最佳提取条件为酶解温度50，酶液浓度0.3mg/ml，酶解时间2.0h。其提取率为4.78%，与传统的提取方法相比，银杏叶黄酮的提取率有较大提高。关键词：银杏叶；黄酮；纤维素酶；醇提 银杏（Ginkgo biloba），别名白果、公孙树，属裸子植物，和它同门的所有其他植物都已灭绝，被称为“孑遗植物”。银杏树是我国古老的树种，它是神奇的医疗之树，其叶、果实、种子均有较高的药用价值，而银杏叶在以往的本草之类药书中记载较少，直到20世纪60年代，国

3、内外学者开发和筛选天然药物时才发现银杏叶可贵的药用价值，在我国第2000年版药典(一部)中，银杏叶已作为法定药物载入，谓其：性味甘、苦、涩、平，归心肺经，功能敛肺、平喘、活血化瘀、止痛，用于肺虚咳喘、冠心病、心绞痛、高血脂，药物学家在对银杏叶的研究中十分惊喜地发现，一片小小的银杏叶，所含成分之多，药理活性之强大出人们意料。银杏叶中有重要药理活性作用的成分有两大类：银杏黄酮和银杏苦内酯。其中银杏黄酮具有许多重要的药理作用1。（1）银杏叶黄酮类化合物能扩张血管，增加外周血液循环的血流速度，降低血胆固醇，改善胆固醇和磷脂比例，抑制血栓的形成；（2）能促进大脑循环代谢，改善记忆功能；（3）具有抗菌消炎

4、，抑制致癌启动因子( TPA)及治疗过敏症和老年痴呆病等作用；（4）它能清除皮肤表面的过氧化物和自由基，减少黑色素的形成，延缓皮肤的衰老过程。银杏叶黄酮类化合物除用于医药和化妆品上外，近年来又拓展到食品、饮料和防治农作物病虫害等方面。既然银杏叶黄酮有如此多的用途，那么进一步开发利用银杏叶具有重要意义。目前银杏叶黄酮的提取方法主要有2：溶剂提取法，超临界流体萃取法（SFE法），高速逆流色谱技术提取法（HSCCC），微波提取法，超声提取法，酶提取法，分子烙印技术。因溶剂提取法操作简单，所需试剂廉价易得，故通常使用此法来进行大规模生产。传统的提取工艺流程为3：银杏叶粉碎60%乙醇提取过滤滤液浓度提取

5、物乙醇溶解过滤滤液蒸馏提取物本试验在此基础上改进工艺流程为：银杏叶粉碎酶水解浸提NaOH-乙醇浸提离心过滤二次醇提离心过滤蒸发浓缩 干燥提取物1.材料与方法11试验材料1.1.1银杏叶 2010年11月初采摘于安徽科技学院银杏路。1.1.2试剂 纤维素酶，BR，酶活力15000.0(U/g)，国药集团化学试剂有限公司；无水乙醇，AR，上海振企化学试剂有限公司；NaOH，AR，国药集团化学试剂有限公司；芦丁，BR，国药集团化学试剂有限公司；NaNO2，AR，上海建信化工有限公司试剂厂。1.1.3仪器 分析天平；HH-S恒温水浴锅，江苏国胜试验仪器厂；TDL-5离心机，050100rpm；R205

6、B旋转蒸发仪；干燥箱；紫外分光光度计。12试验方法1.2.1标准曲线的制备4精确称取芦丁10mg(120烘至恒重)，置50mL容量瓶中，以30%乙醇溶解定容，即为0.2mg/ml芦丁标准液。精确吸取0、1、2、3、4、5mL分别置于编号为1、2、3、4、5、6的10mL具塞试管中，以1号作为对照组，各加30%乙醇6mL，先加5%NaNO2溶液0.3mL摇匀，放置6min，再加10%Al(NO3)3溶液0.3mL摇匀，放置6min，加4%NaOH溶液2mL，用30%乙醇稀释至10mL，放置1520min，在波长510nm处测定各试管中溶液的吸光度(1号做空白)以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘出

7、标准曲线图，并得回归方程。1.2.2银杏叶总黄酮提取率计算方法5精确称取提取物样品0.5g，用30%乙醇溶液溶解，定容于100mL的容量瓶中，吸取1mL置于10mL具塞试管中，以30%乙醇溶液作为空白对照，以下操作同标准曲线制作， 由对应的吸光度标准曲线查出相应浓度，并计算提取物样品总黄酮含量。 银杏叶总黄酮提取率(%)=提取物所含黄酮质量(g)/银杏叶质量(g)100%。1.2.3银杏叶总黄酮的提取工艺6,7 (1)酶解:称取银杏叶粉末5g，液置于具塞锥形瓶中，加入酶液，在不同酶解条件下进行酶解；(2)一次醇提:在酶解液中加入弱碱性乙醇溶液100mL(0.1g NaOH溶于100ml的90%

8、乙醇溶液)，醇提1h；(3)离心：在3500r/min下离心10min；(4)过滤：真空抽率，滤液收集；(5)二次醇提：滤渣用弱碱性乙醇溶液进行二次醇提； (6)浓缩：合并滤液并浓缩得浸膏； (7)干燥；(8)测定含量。1.2.4单因素试验81.2.4.1不同酶解温度对黄酮提取率的影响称取5g银杏叶粉末4份，各加入100mL浓度为0.2mg/mL的纤维素酶溶液，分别置于30、40、50、60的恒温水浴锅中酶解1.0h，按1.2.3银杏叶黄酮的提取工艺路线进行提取，并计算黄酮提取率。1.2.4.2 不同酶液浓度对黄酮提取率的影响称取5g银杏叶粉末4份，分别加入100mL浓度为0.1mg/mL，0

9、.2mg/mL，0.3mg/mL，0.4mg/mL的纤维素酶溶液，再置于40的恒温水浴锅中酶解1.0h，按1.2.3银杏叶黄酮的提取工艺路线进行提取，并计算黄酮提取率。1.2.4.3 不同酶解时间对黄酮提取率的影响称取5g银杏叶粉末4份，各加入100mL浓度为0.2mg/mL的纤维素酶溶液，置于40的恒温水浴锅中分别酶解0.5h，1.0h，1.5h，2.0h，按1.2.3银杏叶黄酮的提取工艺路线进行提取，并计算黄酮提取率。表1 正交试验因素水平Table 1 the levels of orthogonal experiments factors水平 酶解温度A() 酶浓度B(mg/mL) 酶

10、解时间C(h)1 30 0.1 0.52 40 0.2 1.03 50 0.3 1.54 60 0.4 2.01.2.5正交试验 9通过对影响银杏叶提取率的几个因素：酶解温度，酶浓度，酶解时间的试验研究，确定了各个单因素的最佳条件。在此基础上，进一步设计了三因素四水平L16(43)的正交试验来确定最佳试验条件10。所选因素水平见表1。2结果与分析21标准曲线 根据芦丁比色法测得吸光值如表2，由吸光值绘制芦丁标准曲线见图1。表2 葡聚糖标准曲线的测定结果Table 2 Dtermination results of rutin standard curve编号123456芦丁浓度(mg/mL)0

11、0.020.040.060.080.10吸光值(A510nm)00.1170.2100.2930.3590.443根据表3，可绘制芦丁标准曲线，得出回归方程为y=4.32x+0.021，R2=0.9915。图1 标准曲线Fig.1 standard curve22单因素试验分析最佳酶解条件2.2.1酶解温度的确定不同酶解温度对银杏叶黄酮提取效果的影响见图2图2 不同酶解温度对提取率的影响Fig.2 Effect of different zymolysing temperature on the extraction rate由图2可知，在一定温度范围内，随着提取温度的升高总黄酮提取率明显增大

12、，当提取温度为50时，总黄酮提取率达到最大值3.14%，继续升温总黄酮提取率反而下降。这可能是由于温度升高，纤维素酶的活性增强，促使叶片的细胞壁快速水解，提取效率增加；但温度过高，纤维素酶被逐渐灭活，活性下降，细胞壁的水解程度降低，因而提取效果也相应降低，具体原因还需进一步探讨。2.2.2酶浓度的确定不同酶浓度对银杏叶黄酮提取效果的影响见图3图3 不同酶浓度对提取率的影响Fig.3 Effect of different enzyme concentration on the extraction rate由图3可知,在一定范围内，随着酶浓度的增大总黄酮提取率明显增大，当使用的酶浓度为0.2m

13、g/mL时，得到的黄酮最多，提取率为3.36%，但继续增加纤维素酶的浓度总黄酮提取率略有下降。原因可能是随着酶浓度的增大，底物与酶的结合更加充分，随着细胞壁被破坏，叶片内容物的溶出率也就增大，因此总黄酮的提取率增大；随着酶浓度的进一步增加，提取率反而下降有可能是因为酶浓度太高使得酶的活性下降。2.2.3酶解时间的确定不同酶解时间对银杏叶黄酮提取效果的影响见图4图4 不同酶解时间Fig.4 Effect of zymolysing time on the extraction rate 由图4可知，在一定范围内，随着酶解时间的延长，总黄酮提取率明显增大，提取时间达到1.5h时黄酮提取率达到最大值

14、4.00%，继续延长提取时间，总黄酮提取率变化不明显，其原因可能是此条件下银杏叶细胞壁的破坏程度已达到最大化，再延长酶解时间对提取效率的影响不大。故实际提取中应以1.5h为宜。23最佳提取条件的确定表3 正交试验结果与分析Table 2 the results and analysis of orthogonal experiments设计号A（酶解温度）B（酶液浓度）C（酶解时间）提取率(%)11112.7921223.3631334.5141444.5752123.0562234.2872344.6982412.1993132.65103244.09113314.46123423.9813

15、4143.51144214.50154324.61164434.33K13.8083.0003.965K23.5534.0583.750K34.2384.5683.463K43.7953.7684.215R0.6851.5680.753通过正交试验分析，由极差值R可见，酶浓度对银杏叶黄酮提取效果的影响最为显著，酶解温度和酶解时间对提取效果的影响相差不大，但都没有酶浓度的影响大。正交试验结果说明在以纤维素酶溶液对银杏叶进行酶解提取时，最佳酶解条件为A3B3C4，即在酶解温度为50，纤维素酶溶液的浓度为0.3mg/mL时，酶解2.0h为试验条件较合适。为了验证正交试验结果，对水平搭配A3B3C4进

16、行了3次平行试验，试验测得总黄酮提取率均介于(4.780.25)%之间，结果能重复，表明试验工艺条件稳定可靠。3.讨论银杏叶粉末经纤维素酶的处理，组成其细胞壁的纤维素即被酶水解，细胞壁遭到破坏，减少了细胞内的内容物向水解液中的扩散阻力，从而增加了内容物的溶出率，进而提高了银杏叶黄酮的提取率。在不同酶解温度试验中，提取率先随温度的升高而增大，达到最大提取率时又随温度的升高而减小，这可能是因为在一定温度范围内，纤维素酶的活力随温度的升高而增强，致使提取率增大，而达到最适温度后，酶逐渐失去活性，导致提取率下降。在不同酶液浓度试验中，提取率先随酶浓度的升高而增大，达到最大提取率时又随酶浓度的升高而减小

17、，这可能是因为在一定酶浓度范围内，酶解效率随酶浓度的增加而增强，致使提取率增大，而达到最适酶液浓度后，提取率下降，可能是酶浓度太大反而导致酶解效率降低。在不同酶解时间试验中，提取率先随酶解时间的增长而增大，达到最大提取率时又随酶解时间的增长而减小，这可能是因为在一定时间范围内，随时间的延长，溶于酶解液中的黄酮含量逐渐增加，而达到一定时间后，提取率基本不变或者稍微下降，这可能是长时间酶解使得溶出的黄酮有进入细胞，提取率反而略有下降。银杏叶黄酮常规的提取方法是用60%乙醇提取，考虑到黄酮呈酸性，在碱性溶液中溶解度增大，故试验中采用弱碱性的NaOH乙醇溶液（用0.1%NaOH溶液与90%乙醇溶液等体

18、积混合配制而成），通过与对照组单纯的醇提（提取率为3.15%）相比较，提取率较传统工艺有很大提高。4.结论本试验采用酶解醇提相结合的方法提取银杏叶黄酮，酶解正交试验中，所得较佳酶解条件为在酶解温度为50，纤维素酶溶液的浓度为0.3mg/mL时，酶解2.0h的提取条件下，银杏叶总黄酮提取率可达4.78%，并且此提取工艺条件稳定可靠。致谢:在进行此项试验的整个过程中，我因学识有限，在设计试验方案、查找文献以及仪器使用等方面遇到诸多问题，在孙玉军老师的指导和陈珊珊同学的帮助下，我克服了一个个难题，最终完成了整个试验，几个月以来，导师严谨的治学态度，可敬可亲的待人之道给我留下了深刻的印象，使我受益良多

19、，在此，我表示衷心的感谢！也向所有指导、帮助和鼓励过我的老师和同学致以诚挚的谢意！参考文献:1 卢元芳,宫霞.银杏叶黄酮类化合物的提取和药理作用J.曲阜师范大学报,1999,25(3):23-25.2 吕帮玉,杨新河,毛清黎.银杏叶黄酮提取与测定研究进展J.河北农业学,2007,11(3):91-95.3 李国丽,李春霞,王威强.银杏叶黄酮类化合物提取分离研究现状和展望J.山东轻工业学院学报,2005,19(3):54-56.4 张梦军,覃仁辉,聂金媛,等.从银杏叶中提取银杏黄酮甙的工艺比较及试验优化J.第三军医大学学报,2004,26(14):12-16.5 江德安,肖前春.乙醇+NaOH提

20、取银杏叶黄酮方法的研究J.林业科技,2005,30(6):38-41.6 赵钟兴,王飞,韦藤幼,等.解吸-热提两步法提取银杏叶中的黄酮研究J.广西科学，2005,12(2):76-79.7 梁红,潘伟明,张伟锋.银杏叶黄酮提取方法比较J.植物资源与环境,1999,8(3)17-20.8 庞允,杨建秀,刘子兰.银杏叶中黄酮的提取工艺比较J.中国药业,2007,16(3):27-29.9 杨青林,李雷光,李志良.银杏叶黄酮类化合物提取方法的研究J.化学工业与工程,2009,30(1):23-25.10郭国瑞,谢永荣,钟海山,等.超声波提取银杏黄酮苷的工艺研究J,赣南师范学院学报,2001,6(3)

21、:42-45.Study on The Extracting Technology of Flavonoids in Ginkgo Biloba LeavesStudent majoring in Biotechnology Shi Xianlong Tutor Sun YujunAbstract: The experiment was designed to optimize the extraction process and discuss the best extraction conditions of flavonoids in ginkgo biloba leaves, the

22、cellulose enzyme and alkalescent ethanol solution were used, and the methods of zymolysing and ethanol-extraction were combined within the experiment. and compared with the traditional methods of simple zymolysing or individual ethanol-extraction. Inaddition,the influence of different enzyme solutio

23、n factors to the extraction effect of flavonoids in ginkgo biloba leaves was studied. Trials of enzyme solution temperature, cellulose liquid concentration, zymolysing time were did as single factor experiment. And the factors under optimum experimental conditions were found, when compared with the traditional method,the extract effect of flavonoids in ginkgo biloba leaves was greatly improved, and on the basis of that experiment orthogonal experiments were did, and the best extraction conditions were found.Key words: ginkgo biloba leaves; flavonoids; Cellulose enzyme; ethanol-extraction