动植物检疫重点.doc

1、第一章：动植物检疫学重点：动物疫病、检疫性动物疫病的区别；有害生物、动植物检疫概念；动植物检疫的目的；动植物检疫的类型及案例；动植物检疫的属性特点；中国动植物检疫的发展及特点检疫与检验的区别检疫：为防止传染病蔓延，对可能成为传染源的人员、交通工具、物资等采取的隔离观察、检查、消毒等措施检验：包括产品的各个方面，重在包装、规格、质量、内在的品质，包括卫生指标。检疫是针对疫病疫情的一种检验，检验范围更广。检验检疫：一般是指卫生检疫、动植物检疫、商品检验的总称。（三检合一）1、进出口商品检验 法律依据：中华人民共和国进出口商品检验法 检验检疫内容：商品的质量、规格、数量、重量、包装以 及是否符合安全

2、、卫生要求 方式：法定检验、合同检验、公证鉴定和委托检验2、进出境动植物检疫法律依据：中华人民共和国进出境动植物检疫法检验检疫内容：对进出境动植物、动植物产品的生产、加工、存放过程实行动植物检疫方式：进境检疫、出境检疫、过境检疫、进出境携带和邮寄物检疫以及出入境运输工具检疫3、国境卫生检疫法律依据：中华人民共和国国境卫生检疫法和中华人民共和国食品安全法检验检疫内容：对出入境的交通工具、货物、运输容器以及口岸辖区的公共场所、环境、生活设施、生产设备所进行的卫生检查、鉴定、评价和采样检验方式：进出境检疫、国境传染病监测、卫生监督早期动植物检疫的特点：采取强行禁止贸易或引进的方法来预防疫情的传入。动

3、物疫病：危害或可能危害动物及动物产品的任何传染病和寄生虫病。植物有害生物：泛指危害或可能危害植物及其产品的任何生物，即任何对植物或植物产品有害的植物、动物或病原体。检疫性动物疫病和植物有害生物：是指对受其威胁的地区具有潜在经济重要性，但尚未在该地区发生，或虽已发生但分布未广泛并正在进行官方控制的动物疫病和植物有害生物。动植物检疫：是指防止检疫性动物疫病和植物有害生物的传入、传出或扩散，或确保其官方控制的一切活动。动植物检疫的目的防治危险性动物疫病和植物有害生物的传入、传出及扩散；保护农、林、牧、渔业生产安全、人体健康及生态环境；促进国际及国内经济贸易的发展。动植物检疫的范围动植物和动植物产品；

4、装卸容器、包装物和铺垫材料；运输工具；其他检疫（疫苗、血清等等动物：通过贸易、科技合作、赠送、援助等方式进出境的动物， 主要品种为种用或饲养的家畜、家禽，野生动物很少。旅客携带的进境动物，主要为伴侣动物和观赏动物，如猫、狗、鹦鹉、金鱼等邮寄进境的动物，如蚕、蜂等。过境动物：主要包括演艺动物、竞技动物和观赏动物等。动物产品： 通过贸易、科技合作、赠送、援助等方式进出境的动物产品，主要为肉类、毛类。旅客携带的进境动物产品，如皮张、毛类和肉制品。 邮寄进境的动物产品，包括很多产品，如肉制品、奶制品、皮毛等植物：通过贸易、科技合作、赠送、援助等方式进出境的动物，主要品种为种子、种苗 旅客携带的进境植物

5、，主要为盆栽植物、绿化和观赏性树苗和蔬菜重做等邮寄进境的植物，如蔬菜、瓜果种子及花卉繁殖材料等。植物产品： 通过贸易、科技合作、赠送、援助等方式进出境的植物产品，主要为粮谷、水果和木材。旅客携带的进境植物产品，主要为蔬菜、水果、干果、药材等邮寄进境的植物产品，主要为粮食、干果和中药材等。国际动植物检疫现状主要类型环境优越型：如韩国、日本、澳大利亚等水域屏障，自然传播很难，控制人为传播和入侵更为重要，检疫要求特别严格，出境较宽松。发达国家大陆型：地理接壤，相互之间检疫较宽松，但对外检疫要求特别严格。经济共同体大陆型：地理接壤，如欧盟等，制定了统一的原则和措施，相互之间检疫非常宽松，进境非常严格，

6、出境较宽松发展中国家大陆型：如中国，印度，智利、南非等，进境出境较为严格。工商业城市型：如新加坡，香港等，进境的种用产品非常严格，对植物产品较宽案例：在中国圣诞树彩灯中发现亚洲长角天牛，已经花费接近2亿美元根除它，美国对中国圣诞树实施禁令，禁止进口中国圣诞树。动植物检疫的基本属性法制性依法开展工作（国际和国内）预防性预防本国和本地区以外的检疫性疫病和有害生物的传入和扩散。国际性国际公约、国际标准、国际组织等综合性综合管理体系动植物检疫发展特点：执法更加严格；范围不断扩大；政策及时调整；技术逐步提高；宣传全面加强我国的动植物检疫的发展国动植物检疫工作起步较晚 ，经历了从无到有，从弱到强的过程。如

7、今已进入了一个崭新的阶段。原国家进出口商品检验局、原卫生部卫生检疫局和原农业部动植物检疫局共同组建国家出入境检验检疫局；出入境检验检疫局合并组成中华人民共和国质量监督检验检疫总局第二章 动植物检疫法规实施卫生与植物卫生措施协议、国际动物卫生法典、国际植物保护公约、中华人民共和国进出境动植物检疫法、中华人民共和国进出境动植物检疫法实施条例、中华人民共和国动物防疫法、植物检疫条例动植物检疫的法律依据及构成法律、法规、部门规章、协定、协议、规范性文件宗旨：为防止动物传染病、寄生虫病和植物危险性病、虫、杂草以及其他有害生物（以下简称病虫害）传入、传出国境，保护农、林、牧、渔业生产和人体健康，促进对外经

8、济贸易的发展检疫范围：进出境的动植物、动植物产品和其他检疫物，装载动植物、动植物产品和其他检疫物的装载容器、包装物，以及来自动植物疫区的运输工具，依照本法规定实施检疫检疫机构：国务院设立动植物检疫机关（以下简称国家动植物检疫机关），统一管理全国进出境动植物检疫工作。国家动植物检疫机关在对外开放的口岸和进出境动植物检疫业务集中的地点设立的口岸动植物检疫机关，依照本法规定实施进出境动植物检疫。动植物检疫职权范围： 依照本法规定登船、登车、登机实施检疫； 进入港口、机场、车站、邮局以及检疫物的存放、加工、养殖、种植场所实施检疫，并依照规定采样； 根据检疫需要，进入有关生产、仓库等场所，进行疫情监测、

9、调查和检疫监督管理； 查阅、复制、摘录与检疫物有关的运行日志、货运单、合同、发票以及其他单证。禁止进境物：植物病原体（包括菌种、毒种等）、害虫及其他有害生物； 动植物疫情流行的国家和地区的有关动植物、动植物产品和其他检疫物； 动物尸体； 土壤。口岸动植物检疫机关发现有前款规定的禁止进境物的，作退回或者销毁处理其他与动植物检疫相关的法律：中华人民共和国动物防疫法中华人民共和国食品安全法中华人民共和国农业法中华人民共和国渔业法中华人民共和国森林法中华人民共和国传染病防治法中华人民共和国农产品质量安全法现行动植物检疫法规专门法规：1996年12月2日以中华人民共和国国务院令第206号发布的 中华人民

10、共和国进出境动植物检疫法实施条例。其他与动植物检疫相关的法规：中华人民共和国植物检疫条例中华人民共和国邮政法实施细则实验动物管理条例国际航行船舶进出中华人民共和国口岸检查办法重大动物疫情应急条例中华人民共和国濒危野生动植物进出口管理条例 国际检疫机构世界贸易组织 WTO 前身是关税和贸易总协定（General Agreement on Tariff and Trade， GATT），简称关贸总协定 瑞士日内瓦WTO的主要宗旨和目标：提高生活水平，保证充分就业，保证实际收入和有效需求的大幅度稳定增长以及扩大货物和服务的生产和贸易为目的，同时应依照可持续发展的目标，考虑对世界资源的最佳利用。WTO

11、的基本原则：非歧视性贸易原则公平竞争原则；透明度原则；贸易自由化原则；允许正当保护的原则；磋商调解原则；对发展中国家的特殊待遇原则世界动物卫生组织 OIE 法国巴黎联合国粮食与农业组织 FAO 意大利罗马 亚洲和太平洋区域植物保护协会 APPPC 泰国曼谷欧洲和地中海区域植物保护组织 EPPO 法国巴黎近东植物保护委员会 NEPPC 埃及开罗等对动物疫病划分为A类和B类两种疾病。 A类病包括：口蹄疫、猪瘟、高致病性禽流感和新城疫等烈性传染病。 B类病包括：炭疽、布氏杆菌病、牛结核病、狂犬病等人畜共患病及非烈性动物疾病。 植物检疫机构及任务对外植物检疫工作由国家质量监督检验检疫总局下属的出入境检

12、验检疫机构承担，主要任务是在对外开放的港口、码头、机场等场所，对进出境植物和植物产品实施检疫，阻止国外检疫性有害生物的传入；对国内输出的植物和植物产品实施检疫，防止检疫性有害生物的传出对内检疫，全国农业植物检疫工作由省、地和县农业局所属植物检疫（植保植检）机构责管理和实施，全国的森林植物检疫工作由国家林业局所属的森林植物检疫机构负责实施，其主要任务是对检疫性有害生物、应施检疫的植物和植物产品实施检疫管理，组织根除检疫性有害生物或控制其传播蔓延。动物检疫机构对外检疫：中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局（简称国家质检总局），具体任务由分支机构负责。 国家质检总局主管全国质量、计量、出入境商品检

13、验、出入境卫生检疫、出入境动植物检疫、进出口食品安全和认证认可、标准化等工作，并行使行政执法职能的直属机构。省级动物检疫机构职责（1） 部署、检查、指导和协调全省动物检疫工作。（2）负责制定全省动物检疫工作计划和检疫技术规范。（3）负责组织动物检疫技术培训。（4）负责全省检疫员考试、考核、备案，以及检疫员证章发放的审核。（5）纠正违法违规检疫行为。县（区、市）级动物检疫机构的职责（一）负责制定全县动物检疫工作计划。（二）具体实施辖区内动物检疫工作。（三）配合省、市做好动物检疫员、协检员的培训、考试、考核和备案工作。（四）纠正违法违规检疫行为。（五）县（区、市）动物检疫机构的派出机构，具体履行县

14、动物检疫机构的相关职责。 动物检疫员：动物防疫监督机构专门设立、具体实施动物及动物产品检疫的具有相应技术的专业合格人员。第三章 ：动植物检疫程序 掌握我国动植物检疫的基本环节，正确理解检疫许可、检疫申报、现场检验、实验室检测、检疫监管、检疫处理与出证等检疫程序的含义和意义。了解检疫许可的审批手续、检疫申报的办理手续、现场检验的主要方法、疫情监测的主要手段、实验室检测的主要方法检疫许可（检疫审批）：是在输入某些检疫物时，输入单位向检疫机关提前提出申请，检疫机关审查并决定是否批准输入的法定程序。检疫许可作用：避免盲目进境，减少经济损失；提出检疫要求，加强预防传入；依据贸易合同，进行合理索赔检疫申报

15、(报检)：是检疫物输入或输出时由货主或代理人向检疫机关及时申明并申请检疫的法律程序。主要作用：使检疫人员在接到货主或代理人递交的报检材料后，为进一步核对相关单证和实施检疫做好准备。检疫申报是必经的法定程序，由货主或代理人和检疫人员共同完成。报检员：是指获得国家质量监督检验检疫总局规定的资格，在国家质检总局设在各地的出入境检验检疫机构注册，办理出入境检验检疫报检业务的人员现场检疫：是检疫人员在现场环境中对输入或输出的应检物进行检查和抽样，并初步确认是否符合检疫要求的法定程序主要针对运输工具和装载工具、货物及存放场所、携带物及有机物的应检物进行检验，经现场检验采集的样品需送到实验室继续进行检测现场

16、检疫：（1）动物检查有无疫病临床症状，有无外伤和死亡。发现疑似感染传染病或者已死亡的动物时，在货主或者押运人的配合下查明情况，立即处理。动物的铺垫材料、剩余饲料和排泄物等，由货主或者其代理人在检疫人员的监督下，作除害处理动物产品-重点检查外包装是否完整、有无散包和开裂，产品是否裸露、变质、腐败。植物产品-重点检查货物及其存放的仓库或产所，特别是货物的表层、堆角及包装外部和袋脚，通过肉眼或过筛的方法检查有无病瘿、杂草、害虫及害虫痕迹等需要进行实验室检验的也同样根据相关规定采取样品，送至实验室检测。实验室检测：是借助实验室仪器设备对检疫物样品进行动物疫病和植物有害生物的检查、鉴定的法定程序。经现场

17、检验，某些检疫物或从中查检出的有害生物需进一步进行实验室检测，确定动物疫病或植物有害生物的种类，同时还要根据输入国和输出国的检疫要求实施实验室检疫。检测主要方法：动物及动物性样品的实验室检测：主要针对我国对定的一、二类危险性传染病，寄生虫病。方法（详见第四章）病原学检验；血清学检验；病理学检验；分子生物学检验植物及植物性样品的实验室检测：重点检测是否感染了我国所规定的植物一、二类危险性病、虫、草。主要方法：比重检测；染色检测；洗涤检测保湿萌芽检测；分离培养与接种检测；鉴别寄主接种检测；噬菌体检测；血清学检测等现场检疫与试验检疫比较比较内容现场检验 实验室检测实施顺序先；后实施产所现场（机场、车

18、站、码头、邮局、货场等）；实验室（检疫部门、检测中心）主要任务核查单证、抽取样品；制备样品、鉴定种类主要方法肉眼检查；镜检、生化检测等所需设备放大镜、多孔筛、X光机、检疫犬等；高档仪器，离心机，显微镜等人员要求应具备专业基础知识和现场经验；应具备扎实的专业技能、掌握检测方法预检是指动植物或动植物产品入境前，有检疫人员在其生长或生产期间于原产地进行检验、检测，以防止管制性动物疫病或植物有害生物在国际见传播或扩散的一项措施。作用：1便于发现疫情，结果更为准确2 简化检疫手续，加快商品流通3 保护货主利益，避免更大损失4 加强部门合作，增进检疫交流隔离检疫是指将进出境或国内调运的有关动植物在检疫机关

19、指定的产地内，于隔离条件下进行饲养或种植，并在其期间进行检验、检测和处理的一项措施。作用：有助于解决现场检疫的后续检疫问题；有助于避免或减少检疫中的漏检问题；有助于进一步提高检疫即结果准确度问题；有助于更有效地管制有害生物的输入或输出检疫处理：指检验检疫机构根据检验、检测结果以及相关的规定，采取一定的方式对检疫物实施处理的法定程序。对违章入境或经检疫不合格的进出境动物、动物产品和其他检疫物采取的除害、扑杀、销毁、退回、截留、封存、不准入境、不准出境、不准过境等措施。检疫处理方法：1、除害：通过物理、化学和其他方法杀灭有害生物，包括熏蒸、消毒、高温、低温辐照等。2、扑杀：对经检疫不合格的动物，依

20、照法律规定，用不放血的方法进行宰杀，消灭传染源。3、销毁：即用化学处理、焚烧、深埋或其他有效方法，彻底消灭病原体及其载体。4、退回：对尚未卸离运输工具的不合格检疫物，可用原运输工具退回输出国；对已卸离运输工具的不合格检疫物，在不扩大传染的前提下，由原入境口岸在检验检疫机构的监管下退回输出国。5、截留：对旅客携带的检疫物，经现场检疫认为需要除害或销毁的，签发出人境人员携带物留验处理凭证，作为检疫处理的辅助手段。6、封存：对需进行检疫处理的检疫物，应及时予以封存，防止疫情扩散，也是检疫处理的辅助手段。检疫处理总的原则是：在保证动（植）物病虫害不传入或传出国境的前提下，同时考虑尽量减少经济损失以促进

21、对外贸易的发展。能作除害灭病处理的，尽可能不进行销毁。无法进行除害处理或除害处理无效的，或法律有明确规定的，要坚决做扑杀、销毁或者退回处理，作出扑杀、销毁处理决定后，要尽快实施，以免疫病进一步扩散第三节 病毒分离及鉴定标本采取的原则： 1. 病毒标本的采取应尽早为好. 2.由于大多数病毒对热不稳定，应该立即接种， 如果不能及时接种或需保存，一般置50甘油盐水4或-20以下保存。病毒的分离培养：动物接种培养 ；病毒的鸡胚培养 ；病毒的细胞培养动物接种是最原始的病毒培养方法。主要用于目前无法用细胞、鸡胚培养的病毒。通过机械解离或消化 等方法将组织或细胞 从机体取出，分散成 单个细胞，给予必要 的生

22、长条件，模拟体 内生长环境，使其在 体外能继续生长繁殖 ，称为细胞培养。 病毒的细胞培养步骤： 病料处理 病毒分离、繁殖 细胞病变（CPE）观察在动物疫病诊断和检疫中，现代生物技术 的应用主要体现在两方面： 一是基于抗原抗体反应的免疫血清学技术 ；二是基于病原核酸检测分子生物学技术。完全抗原 ：具有免疫原性和反应原性的抗原，如大多数蛋白质、细菌、病毒、细菌外毒素等。半抗原 ：很多小分子物质不能单独刺激机体产生抗体或致敏淋巴细胞，但能与相应的抗体或致敏淋巴细胞发生特异性反应，此类物质称半抗原。抗体：是B细胞识别抗原后活化、增殖分化为浆细胞，由浆细胞合成和分泌的能与相应抗原特异性结合的球蛋白多克隆

23、抗体：由多个抗原决定簇刺激不同的B细胞产生的单克隆抗体：由一个B细胞分泌的抗体基因工程抗体：应用基因工程技术对需要的抗体进行改造所获得的抗体第四章 动物的检验检疫技病料采集和运送1、在采取病料前必须对被检动物可能患有何种疫 病作出初步诊断； 2、采取病料所用的容器、手术器械均应灭菌后才 能使用，采样时应无菌操作；3、解剖前检查（只有在确定不是炭疽后，方可剖 解）； 4、取材时间要早（死后6h内）； 5、应根据不同的疫病相应的采取脏器或内容物； 若无法估计是某种疫病，可全面的采取。（脓汁 、血液、皮肤、骨头、脑、脊髓等）细菌分离及鉴定是用人工的方法使细菌在 适当的环境和营养基质中生长繁殖，获取

24、纯种、进行鉴定与研究等。 为达到细菌分离及鉴定的目的，运用 无菌技术 提供适当的培养基 适宜的培养方法和条件分离接种平板划线接种法 斜面接种法 倾注培养法 穿刺培养法 半固体培养法 液体培养法 平板涂布培养法细菌培养方法：需氧培养法；二氧化碳培养法（CO2孵箱法、烛缸法、化学法）；厌氧培养法（厌氧罐培养法、培养箱法） 细菌染色方法有： 简单染色法：只用一种染料进行染色。 复杂染色法： 革兰氏染色法 抗酸染色法（抗酸菌呈红色，非抗酸菌呈蓝色） 瑞特氏染色法（细胞核呈蓝色，细胞浆呈红色） 姬姆萨氏染色法（细胞核呈蓝色，细胞浆呈红色）生化试验 ：细菌的生化试验是继形态学鉴定之后，又一重要鉴 别依据。

25、 糖类分解试验 ；吲哚（靛基质）试验 ；淀粉水解试验 ； V-P试验 ；甲基红（M.R）试验 ；柠檬酸盐利用试验 ；凝固血清紫牛乳试验 ；硫化氢试验 ；硝酸盐还原试验；尿素酶试验肉与肉制品概念白条肉（家畜胴体）：除去毛或皮、头、蹄、尾和内脏的部分光禽（家禽胴体）：去掉毛、内脏、爪的部分下水：头、蹄、内脏和爪统称副产品或下水肉制品：将原料肉经过进一步加工处理生产出来的产品1、形态结构肉主要由肌肉组织、脂肪组织、结缔组织、骨骼组织组成，另外还包含神经组织、淋巴组织及血管等。2、肉的化学成分 主要由蛋白质、脂肪、水份、维生素和矿物质组成3、肉的物理性状包括肉的颜色、肉的风味、肉的嫩度、肉的保水性等我

26、国畜禽屠宰卫生检疫基本规范 1、国家对生猪等动物实行定点屠宰，集中检疫。 2、动物防疫监督机构对依法设立的定点屠宰场（厂、点）派驻或派出动物检疫员，实施屠宰前和屠宰后检疫。 3、对动物应当凭产地检疫合格证明进行收购、运输和进场（厂、点）待宰。4、动物检疫员负责查验收缴产地检疫合格证明和运载工具消毒证明。5、动物产地检疫合格证明和消毒证明至少应当保存十二个月。 产地检疫和宰前检疫1、定义 产地检疫是指县境内流通的畜禽，在离开饲养生产地之前所实施的检疫也就是要到场到户检疫。产地检疫主要由乡镇畜牧兽医站具体负责。宰前检疫只是屠宰检疫的一个环节，即在畜禽屠宰前依法实施的检疫。检疫的地点产地检疫是在饲养

27、场内进行，而宰前检疫只能在屠宰场内进行。3、检疫对象及要求 产地检疫要求家畜来自非疫区，临床检查健康，即动、静、食、体温正常，即为合格。而宰前检疫实施前首先要查验和收缴产地检疫证明或运输检疫证明，然后实施检疫，除要家畜临床检查健康外，还对不同的家畜特别要求检不同的检疫对象。产地检疫的畜主是饲养生产者，而宰前检疫的畜主主要是进入流通的经营者。宰前检疫的意义收购时对活的畜禽检疫，可以避免购入患病畜禽减少经济损失入场时检疫，可及时发现病情，防止疫病扩散宰前检疫可以检出宰后检验时难以检出的疾病宰前检疫及时发现疫情，查找疫源地。宰后检验是检疫人员应用兽医病理学知识和实验室诊断技术，依照规定的检疫项目、标

28、准和方法，对解体后的畜禽胴体、脏器及组织进行的检验及综合性卫生评价。宰后检疫的基本方法（1）宰后检验主要是通过感官检验对胴体和脏器的病变进行综合的判断和处理，必要时辅以细菌学、血清学、病理组织学等实验室检验。（2）方法主要有视检、剖检、触检和嗅检，以视检和剖检为主 PCR技术的原理1、PCR基本原理-无细胞分子克隆法在微量离心管中，加入：适量的缓冲液微量的模板DNA，四种脱氧单核苷酸，一对引物，耐热性多聚酶3个温度循环高温变性 94低温退火 55 30中温延伸 72三个阶段为一个循环，每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍，一般样品是经过30次循环，最终使基因放大了数百万倍;；扩增特异区段的

29、DNA带。加热或强酸、碱性作用使 DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离，形成单链DNA，这称为 DNA的变性。解除变性的条件后，变性的单链可以重新结合起来，形成双链，其原有的特性和活性可以恢复，这称DNA复性，也叫退火。PCR技术的特点1） 高度的灵敏性2）特异性3）操作简便易行4）用途广泛引物设计：（1)序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列。（2）引物长度以15-40 bp为宜。（3）碱基尽可能随机分布，G+C占50-60%。（4）引物内部避免形成二级结构。（5）两引物间避免有互补序列。（6）引物3端为关键碱基；5端无严格限PCR的反应体系和方法PCR管加热使模板变性， 退火使引物与模板D

30、NA互补，延伸需将反应温度升至中温( 72)，在Tap多聚酶的作用下，以dNTP为原料，以引物为复制的起点，合成新链。如此重复改变反应温度，即高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环，每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍，一般样品是经过30次循环，最终使基因放大了数百万倍；将扩增产物进行电泳，经溴化乙锭染色，在紫外灯照射下肉眼能见到扩增特异区段的DNA带。PCR反应条件1） PCR反应成分：（1）模板：单、双链DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。一般100ng DNA模板/100mL。模板浓度过高会导致反应的非特异性增（2）引物浓度0.1-0.5

31、 mmol/L浓度过高易导致模板与引物错配，反应特异性下降。（3）Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)0.5-2.5 U/50 ml酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。（4）dNTPdNTP浓度取决于扩增片段的长度四种dNTP浓度应相等浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。（5） Mg2+Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高影响反应特异性。Mg2+可与负离子结合

32、，所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度、2）循环参数变性使双链DNA解链为单链94oC 20-30秒(2) 退火温度由引物长度和GC含量决定。增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。（3）延伸（3）70-75，一般为72延伸时间由扩增片段长度决定（4）循环次数主要取决于模版DNA的浓度一般为25-35次次数过多：扩增效率降低错误掺入率增加PCR的类型1）不对称PCR目的：扩增产生特异长度的单链DNA。方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物，其最佳比例一般是0.010.5M，关键是限制性引物的绝对量。用途：制备核

33、酸序列测定的模板制备杂交探针基因组DNA结构功能的研究2)反向PCR 是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。可对未知序列扩增后进行分析，如探索邻接已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆，扩增基因文库的插入DNA；建立基因组步移文库。3）多重PCR（复合PCR）用于检测特定基因序列的存在或缺失4）LP-PCR（Labelled primers)利用同位素、荧光素等对引物进行标记，用以直观地检测目的基因。特别适合大量临床标本的基因诊断可同时检测多种基因成分5）锚定PCR（anchored PCR， A-PCR）PCR的局限：需了解靶基因片段两测的序列6） PCR固相分析法7）原位原位聚合酶链式反应（In Still PCR，IsPCR）是由Haase等于1990年首创。它是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段，在不破坏细胞的前提下，利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行扩增。可进行细胞内定位。适用于检测病理切片中含量较少的靶序列9) 荧光定量 PCR（real-time PCR)通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标 记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对结果进行分析，计算待测样品的初始模板量。