葡萄糖氧化酶与血糖试剂盒的研制.doc

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1、54甘肃科学学报1992年第1期1992年 第1期(总第10期）甘肃科学学报Journal of Gansu Sciences葡萄糖氧化酶与血糖试剂盒的研制罗侃崔有宏(兰州部队军医学校生化教研室，兰州，730020摘 要葡荀糖氡化時是測定血糖的关键工具酶，本文研究了用点青霉As. 3. 3871 株发 酵生产薷荀糖氧化酶的工艺和制酶试剂盒的方法，研究的产品婭栓測符合国家卫生部 临床检骆中心的技术标准，临床验证表明与国内同类产品品廣相同，填补了西北地区的 空白，有良好的应用前景。关键词：点青霉、葡荀糖氡化酶、A糖葡萄糖氧化酶（Glucose Oxidase，GOD)血糖测定法具有特异、准确、灵敏

2、、简便、快速、无 毒等优点，因而现已成为首选推荐方法。由于该酶的发酵生产程序复杂，国内目前生产的厂家不 多，运输和供应尚不能满足需要。为了解决就近供应问题，我们进行了 GOD的发酵、提取工艺和 测定血糖试剂盒的研究，并开始批童生产。一、材料和方法1. 菌种：点青霉（penicilliumnotatum) As. 3. 3871菌株，购自中国科学院北京微生物研 究所。斜面和平皿培养采用czapeks培养基，其成份见文献1。摇瓶及发酵罐培养液的配方按文献 并将蔗糖用量增大至7%。2. 设备：往复式摇床和38L不锈钢密封式通风发酵罐参照华东B_BraUn 30L组装罐的主要 技术指标设计制作3。成套

3、设备经安装调试，性能符合设计要求。3. GOD的分离采用离子交换树脂（南开大学化工厂产，牌号110)柱层析法。树脂活化参照 文献进行。分离柱直径70mm，长900mm。洗脱液配方及洗脱程序见文献2。洗脱液的酶峰部 份经002型超滤器浓缩处理并进一步用DEAE纤维素柱层析法除过氧化氢酶后，再次浓缩即得 浓缩酶液。4. GOD活性检测用邻联茴香胺比色法。蛋白质测定按照lowry法5. 过氧化氢酶活性测定按文献5进行。6. 葡萄糖氧化酶过氧化物酶（pferoxidase, POD)法血糖测定试剂的配制按文献进行。 GOD自产，POD购自上海东风生化试剂厂，4 一氨基安替比林、酚、叠氮钠、磷酸盐等均系

4、国产 分析纯试剂。二、结果与讨论1、菌株的复壮：As. 3. 3871菌株经斜面一摇瓶一平皿反复培养复壮，使摇瓶培养液产酶能力 由最初2. 6v/ml，经14个月31代培养后得到产酶25. 9v/ml的生产菌株。2、 发酵工艺：发酵液配方同摇瓶培养液，以自来水为溶剂配制251，用lmol盐酸或lmol氢 氧化纳溶液调pH至5. 60,经高压蒸汽灭菌30分钟后迅速冷却至27C时接种，通气量为1 : 0. 6收稿日期：1991 一 09 280.8,搅拌速度230转/分。在发酵全过程中，定时连续监测下列项目：罐内温度发酵液PH值 糖耗情况镜检菌丝生长情况以及有否杂菌污染GOD活性测定含铁量测定等。

5、对发酵周期 的动态观察表明，发酵至2829小时，培养液中的蔗糖基本耗尽，pH亦降至最低点，菌丝开始 向发酵液中释放GOD,到约52小时达到髙峰。上述变化曲线如图1所示。发酵和提取工艺流程简易图配制发酵培养液AS, 3,3871 菌株灭菌空气过滤系统斜面及平皿培养1反复复壮）冷却无菌空气11I摇瓶培养一-接种一-通风发酵I1Y发酵液过滤除去菌丝I滤液I离子交换洗脱液I.超滤浓缩酶液I进一步纯化在发酵液中铁离子明显抑制GOD的生成。发酵液中Fe2+含量增加，产酶量会降低。当Fe2+ 达到10PPm时，可使产酶量降低1/3左右7)。尽管我们使用不锈钢罐，但Fe2+尚可来自水质、蒸 汽管道和发酵原料，

6、为此我们在早期发酵实验中作了两次发酵液Fe2+的测定，均未超过4PPm。经过16个月34次发酵实践，较好的掌握了点青霉深层通风发酵的实验条件，使酶产量由初 期的0. 74u/ml发酵液，逐步地提高到23, 36u为批童生产提供了技术保证。3、GOD的制取、纯化和品瑪：在发酵液中GOD含量很低（200u/mg的规定标准8，过氧化氢酶的活性则下降到GOD 活性的0.4%以下，符合配制酶法测定血糖试剂的质量要求。有人曾使用过DEAESelectacel柱 和DEAESephadex柱去除GOD酶液中的过氧化氢酶7,但这些试剂昂贵，而DEAE 纤维素 的价格较低，适于大量制备。4、酶试剂盒的质量检测与

7、评价：葡萄糖氧化酶法试剂盒现在国家尚无统-的质量标准。，们 参照有关文献的要求作了质量检测，结果见表1。队表1可以看出，本试剂盒的主要技术指标已 达到文献标准。71994-2015 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved, 我们还将自产酶试剂盒与国家定型同类产品（北京化工厂产品，批号910517)作了对比试验, 测定40份浓度高低不同的病人血淸样品，浓度范围从1. 26423.145imnl/l，自产酶试剂测定平 均值为9. 801mmol/l，北京化工厂试剂平均值为9. 827mmol/l

8、，差值的均数为0_ O26tnmol/1，t检 验p0. 05,相关系数（丫）=0.9998。对比试验数据的散点图如图2所示，以上实验结果表明两 种酶试剂相关性良好。 IE/3UI*pH O61824 30 36424854 60 66发酵时间(h)J128 4 C! )le/n却迪饞2 0 8 6 4 2 2 111812162024北京化工厂*试剂*定值(nunol/L)困发酵周期中#耗、pH和产峰：|的变化困2自产与北京化工厂生产的GOD对脒实 验数振散点困表1自产酶试剂倉的质置检测检 测项目文 献标准自 检结果1.工具酶浓度GOD1200U, PD1200u/d丨酶应用 液GOD120

9、0u, POD1200u/dl 酶应用 液2.显色完全与稳定时间371C15分钟和60分钟37TC15分钟和120分钟3.线性范围45-360mg/dl0400mg/dl4.准碗度回收率在15%以内回收率98.5600. 14%5.稍密度批内CV%不大于1.88% 批间CV%不大于2.15%批内 CV% = 0_65% 批间 CV% = 0_88%6.热稳定性酶液置4X：冰箱稳定4个月，酶酚 混合液置4C冰箱稳1个月酶液放4_C冰箱稳定8个月，酶酚 混合液置4C冰箱稳定32天56甘粛科学学报1992年第1期临床应用结果：将自产GOD酶试剂盒经兰州军区总医院、甘肃省临床检验中心和省人民 医院等5

10、个医疗单位的生化室试用证明，自产酶试剂盒与保定长城临床试剂公司及北京化工厂同 类定型产品性能基本相同（表2)。本研究填补了西北地区的空白，可供试生产和应用。表2与国产酶试剂盒检测性能对比（自产酶试剂盒批号910628号)验证参照试观测浓度范围测定值平均值（mmol/I)差值均数(1 )- C2) (mmol/1)t检验相关系数单位剂盒例数(mmol/I)自产酶试剂合参照酶试剂盒（2)结果兰州军区总 医院检验科保定长城临 床试剂公司(批号 900908)602. 98 32. 325- 595. 580. 01p0. 050.9997解放军第一 医院检验科北京化工厂 (批号 910615)512

11、. 91 16. 905. 545. 530. 01p0. 050. 9990甘肃省临床 检验中心北京化工厂 (批号 910615)493.15-20. 286. 966.990 03p0. 050. 9984甘肃省人民 医院检验科北京化工厂 (批号 001017)503. 84 13. 856. 216. 24 0. 03p0. 050. 9950兰州医学院第一 附厲医院检验科北京化工厂 (批号 910517)452. 9720. 207. 087. 15-0. 07p0. 050. 9970参考文献中国微生物菌种保藏管理委员会编著，中国菌种S录，第1版，第381、45页，轻工业出版社， 北

12、京，1983年。葡萄糖氧化酶协作组，点青霉 (Penicillium notatum) As. 3. 3871 葡萄糖氧化酶的研究，微生物 学通报，第1期，第1页，1974,华东生物技术工程公司，组装BiostatuE 30D.发酵罐使用说明书，1S89年。鲁子贤主编，蛋白质和酶学研究方法.，第1册，第1版，第56页，科学出版社，北京，1Q89年。 蒋传葵等编著，工具酶的活力测定，第1版，第36页，上海科学技术出版社，上海，1兆2年。 中华人民共和国卫生部医政司编，全国临床检验操作规程，第1版，第159页，东南大学出版社， 南京，1991年。7CII 8张树政主编，酶制剂工业，第1版，下册，第

13、683页，科学出版社，北京，1兆4年。陈惠黎主编，生物化学检验技术第1版，第183页，人民卫生出版社，北京，年。THE FERMENT PRODUCTION OF GLUCOSEOXIDASE AND PRODUCTION OFTHE BLOOD-GLUCOSE REAGENT KITLuo Kan and Cui Yongbong(Biochemistry Department of Lanzhou Military Medical School, Lanzhou* 730020. P. R. China)ABSTRACTGlucose Oxidase is the key enzyme i

14、nstrument of blcxxl lucose determination. This article studied the techonology of ferment production glucose oxidase and its method of compounding enzymic reagent kit, of which we used penicillium notatum AS3. 3871 strain. The developed production conformed to the technical index of clinical laborat

15、ory center of the Health Ministry of P. R. China. The clinical testing showed it had the same quality compared with the same domestic production and could fill the blank of the northwest area. It has a good future for application.Key words： Penicillium notatum, glucose oxidase GOD，blood lucose.甘肃科学学

16、报征订启事一、甘肃科学学报为甘肃省科学院主办、国内外公开发行的自然科学、 边缘学科、交叉科学学术性刊物，季刊。每季末月出版发行，每期定价3. % 元（含邮费）。全年4期，共计15. 60元。二、本刊暫自办发行，请订户将款頊通过银行汇至：工商银行兰州市东 岗办事处，帐号：89802,户名：甘肃省科学院困书情报资料室（请注明 订阅期号及数量）或将订款通过邮局直接寄：甘肃省兰州市定西南路77号 甘肃科学学报编辑部邾新民同志收，如需订单请来信索取。邮政编码： 730000，电话 25211 转。三、本刊1989年1991年过刊还有少量存书，如有未订到者，亦可 向编辑部汇款每本3元，以便邮寄。甘肃科学学报编辑献71994-2015 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved,