我国肿瘤基因治疗的现状及发展趋势.doc

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1、我国肿瘤基因治疗的现状及发展趋势关键词 肿瘤 基因治疗 趋势肿瘤死亡率高，生存期短，严重威胁人们的身体健康。目前临床上传统的肿瘤治疗方法包括放疗、化疗和手术治疗以其局限性促使人们寻找新的抗肿瘤治疗方法。随着分子生物学和免疫学理论及技术的发展和对肿瘤分子机制认识的深入，以及转基因技术的日趋成熟，肿瘤的基因治疗已成为现代广大肿瘤学者的研究热点。肿瘤的基因治疗就是将一个治疗基因“捆绑”在“病毒”上，随后将这种载有治疗基因的“病毒”感染肿瘤患者或肿瘤细胞，使治疗基因进入肿瘤细胞，进而“摧毁”肿瘤细胞。肿瘤基因治疗因其具有特异性、安全性、有效性的特点而受到越来越多的关注，而且许多实验及临床研究取得了满意

2、的效果。近年来，对肿瘤免疫、肿瘤病因及分子机制等研究的不断深入，肿瘤基因治疗方法获得突飞猛进的发展，并逐渐走向成熟。1、 我国肿瘤基因治疗的现状我国是较早开展基因治疗研究和临床试验的国家。早在1985年，吴曼院士就提出了肿瘤是基因治疗的重要目标。经过几十年的发展，在基因导入和基因治疗研究和临床试验等方面都取得了很大进展，目前我国已有重组腺病毒-p53抗癌注射液,TK基因治疗恶性脑胶质瘤,以树突状细胞为基础的肿瘤细胞治疗与基因治疗、IL-2基因工程胃癌细胞瘤苗、HSV-tk基因治疗肝癌等几个肿瘤基因治疗方案进入了临床试验阶段，并建立了生物领域病毒载体研发基地，主要开展腺病毒相关病毒载体用于治疗肿

3、瘤的实验和临床试验研究。目前我国已经有30余个具有自主知识产权的基因治疗方案，并在进行临床试验。2、肿瘤基因治疗的内容21、肿瘤基因治疗的策略（1）免疫基因治疗，又称细胞因子基因治疗，通过转导细胞因子基因，增强机体抗肿瘤免疫能力；（2）自杀基因治疗，使肝癌细胞产生对某些药物前体的特异敏感性而被杀；（3）基因置换或补充，置换突变的基因或补充缺失的抑癌基因；（4）反义苷酸技术，用于抑制癌基因的表达。22、肿瘤基因治疗基因工程的程序 首先取得所需要的基因即目的基因，将其同载体连接，再将经过重组的环状DNA即质粒引入受体细胞，并使目的基因和载体上其他基因的性状得以表达等几个环节。（1）在内切酶的作用下

4、分离制备待克隆的DNA片段；（2）将目的基因与载体在体外连接形成重组DNA；（3）重组DNA进入宿主细胞；（4）筛选、鉴定阳性重组子；（5）重组子的扩增。23、肿瘤基因治疗基因工程所需的载体 虽然内切酶解决了异源DNA体外重组的技术问题，但是重组之后的异源DNA还必须回到细胞内才能显示出其生物活性。这就要求有一种运送载体来充当此角色。微生物中有一种非染色体一种环状DNA或病毒可以做为载体，这样载体的共同特点是：（1）它们都是环状DNA；（2）都能专一性的感染某一细胞；（3）都具有某种选择性标记；（4）都具有一些内切酶的酶切位点；（5）都可以随染色体的复制而独立复制，随着细胞的分裂而扩增。24、

5、肿瘤基因治疗基因工程所需的工具酶 只有在DNA限制性内切酶、载体质粒、连接酶及其它修饰酶的作用下，才能实现随心所欲地移动和改造基因。内切酶的共同特点是：它们都有专一性的DNA识别顺序，都能在DNA链当中切开DNA，故称“内切”的酶。但切开的方式有两种：（1）切成粘性末端；（2）切成平末端。基因工程研究就是利用了内切酶可以专一性地把DNA切割成特定的粘性末端的特点，根据研究工作的实际需要，把一些不同来源，具有粘性末端的DNA片段重新连接或组合起来，这就是DNA技术的来由。25 肿瘤基因治疗基因工程所需的细胞 293细胞是传染腺病毒ELA基因的人胚肾上皮细胞系，有致瘤性，是转化细胞。细胞感染病毒后

6、，首先是细胞形态的变化，由于病毒能增强细胞膜的渗透性，细胞外的离子钠离子流入胞内，细胞可从原来的形态变为圆形，然后由于细胞支架的降解或破裂导致细胞从基质上脱落，最后破裂。3、肿瘤基因治疗的几种方法：31补偿性基因疗法肿瘤的发生多是由于癌基因的突变、扩增、过度表达或抑癌基因的缺失、失活等原因所引起，补偿性基因治疗是指向缺失某种抑癌基因的细胞内导入正常的抑癌基因，逆转肿瘤细胞的表型、抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡等，以达到治疗目的。用基因替代等方法可恢复和增强肿瘤抑制基因的功能，如将克隆的抑癌基因Rb、p53 、p16 等导入肿瘤细胞，可以逆转其恶性行为，诱导细胞凋亡。目前研究最多、临床应用最广泛的是

7、p53基因，研究显示，当p53基因被导入肿瘤细胞后，肿瘤细胞出现了明显的凋亡；此外，有研究采用腺病毒载体介导的p53 基因治疗鼠卵巢癌取得了显著的效果，并发现该治疗在产生旁观者效应的同时，也诱导包括N K(natural killer) 细胞在内的免疫机制参与了对肿瘤细胞的杀伤作用。目前，由我国独立研发的基因治疗药物今又生（重组腺病毒-p53基因颗粒）已被批准上市，其上市前后的临床研究显示，该药物对于鼻咽癌、头颈部鳞癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌、卵巢癌等多种实体瘤均有较好疗效，联合放、化疗可显著提高疗效，其副作用小、不良反应轻（多为自限性发热），有较好的临床应用前景。但由于肿瘤发生、

8、发展的机制十分复杂，涉及多种癌基因和抑癌基因的多步骤改变，因而难以通过拮抗某一种癌基因完全控制肿瘤的恶性行为。 32干扰性基因疗法干扰性基因治疗是指利用反义核酸技术用人工合成的DNA特异性地封闭癌基因、生长因子或/和受体基因的片段，或利用核酶特异性地封闭和切割癌基因的mRNA，从而达到治疗肿瘤的目的。例如Deng等利用编码N2Myc下游调控基因2的cDNA转染胶质瘤细胞，使肿瘤细胞的增殖受到明显抑制；有人用IGF2 R 和R 的反义cDNA 质粒转染肝癌细胞，使癌细胞的恶性程度下降、生长减慢；ras基因对肿瘤的发展与存活有重要的意义，因此可以应用FTIs 或反义寡核苷酸抑制ras的表达；此外还

9、有使用载体介导的RNA干扰稳定地抑制k-ras 的表达的报告。另外有研究发现，在真核细胞内某些双链RNA 能高效、特异地结合、降解互补mRNA，阻断特异基因的表达，导致细胞出现特定基因缺失的表型，并将此现象称为RNA干扰(RNA interference)，其中2125nt大小的短双链RNA称为siRNA（small interfering RNA ,siRNA）。与常用的反义技术相比，RNAi抑制基因的表达不但高效特异，而且效应持久、操作简便，在恶性肿瘤的基因治疗中，运用RNAi技术可以有效地沉默癌基因、促进凋亡、调控细胞周期、抗血管生成等，从而达到治疗肿瘤的目的。Lewis等将siRNAs

10、注射入新生小鼠体内进行荧光素酶基因表达阻断的研究，结果证实多个脏器对RNAi有效，包括肝脏、肾脏、脾脏、肺、胰脏等；新近对结肠癌荷瘤裸鼠模型应用RNAi研究证实其在体内具有抑制肿瘤生长的作用。以上事实说明了siRNAs临床应用的可行性，但是，由于目前尚没有合适的转基因技术，RNAi 在临床肿瘤治疗上的应用有待于进一步研究。 33免疫基因疗法免疫基因疗法是指利用基因进行免疫治疗，包括细胞因子基因治疗、制备肿瘤DNA 疫苗等。由于在肿瘤的发生发展过程中存在着机体免疫系统对肿瘤细胞的免疫耐受状态，而这种状态可能源于肿瘤细胞本身的免疫性不强(如MHC表达不足)、也可源于抗原递呈细胞(APC)不能提供足

11、够的刺激信号(如B7)、或者机体免疫因子分泌不足等，因此可以通过以下方法纠正机体肿瘤免疫的耐受状态：将某些细胞因子(如IL-2、IL-4、IL-1、IL-6、IL-7、INF-、TNF-、G-CSF、GM-CSF等)的基因转染到机体免疫细胞(如TIL、LA K、CTL、TAL及巨噬细胞细胞等)中，以提高机体免疫系统对肿瘤细胞的识别和反应能力；也可通过细胞因子受体基因转染的方法，使肿瘤细胞表面相应的细胞因子受体表达增多，使对肿瘤细胞有直接生长抑制或杀伤作用的细胞因子结合增多，从而将大大增强细胞因子的抗肿瘤效果。由于肿瘤细胞存在功能性MHC I类抗原和(或)共刺激信号表达不足，可以将一些与免疫识别

12、有关的基因(如HLA B7等)转染到体外培养的肿瘤细胞，经照射后再植入肿瘤患者体内；或者将表达HLA B7的病毒载体或质粒DNA与脂质体复合物直接注射到瘤体内，以增强肿瘤细胞对机体免疫系统的免疫原性，诱导机体的免疫反应。制备肿瘤DNA疫苗，将编码特异抗原的基因直接注入人体，通过其在机体内的表达，从而可以激发机体对编码抗原的免疫反应。 34抗血管形成基因疗法 肿瘤的生长、转移与新生血管的形成密切相关，由于肿瘤的血管生成受到血管生长因子、血管生长抑制因子以及其它的因子的共同调控，因此通过阻断促血管生长因子作用或者强化血管生长抑制因子的表达均可达到治疗的目的。抗血管形成的基因治疗机制主要包括以下几个

13、方面：阻断血管生长因子的作用，主要是采用反义DNA、中和性抗体、受体酪氨酸激酶的抑制剂以及核酶等。除阻断VEGF的表达外，还有针对其它的血管生成因子的治疗，如bFGF、缺氧诱导因子( HIF)、EGF、PDGF、PDECGF、IGF、Ets21、HGF等的因子的治疗。上调血管生长抑制因子，例如用重组血管抑素cDNA输入消化道肿瘤可取得较好的治疗效果，用编码内皮抑素的重组腺病毒载体可抑制内皮细胞迁移和VEGF介导的血管生成，还有研究发现病毒载体介导的重组编码PF4的反义基因显示出抗鳞癌血管生长的作用。抑制细胞外基质和基膜降解以及抑制内皮细胞特异性粘附分子的作用。35自杀基因疗法肿瘤自杀基因疗法又

14、称病毒介导的酶/药物前体疗法，是指将药物敏感基因转染肿瘤靶细胞并使之表达，基因编码的酶将无毒的药物前体转化为具有细胞毒性的代谢物，从而诱导靶细胞产生自杀效应，杀伤肿瘤细胞，同时还可通过旁观者作用杀伤邻近未转染的肿瘤细胞；其作用机理包括促进免疫效应细胞的分化增殖、加强对肿瘤的杀伤力、直接杀伤癌细胞、增加肿瘤细胞的免疫原性等。这类前药转换酶基因又被称为“自杀基因”。目前研究较多的自杀基因系统包括：大肠杆菌胞嘧啶脱氧酶/5-氟胞嘧啶(CD/5-Fc)系统、单纯疱疹病毒胸苷激酶基因/丙氧鸟苷(HSV-TK/GCV)系统、胞嘧啶脱氨酶/单纯疱疹病毒-1-胸苷激酶(CD/TK)系统等。HSV-TK/GCV

15、系统将无毒的药物前体丙氧鸟苷(GCV) 磷酸化，转变为毒性药物三磷酸GCV，三磷酸GCV可以明显抑制细胞DNA聚合酶，从而抑制蛋白质的合成，杀伤肿瘤细胞。CD/5-FC 系统能将无毒的5-Fc脱氨酶转变为5-Fu，5-Fu再转化为5-FuTP 或5-FdUMP，发挥细胞毒性作用。近年来，又有学者发现了新的自杀基因，即嘌呤核苷酸磷酸化酶(PNP)基因，PNP可将无毒的前药6-甲嘌呤脱氧核糖(6-MPDR)转变成毒性产物6-甲嘌呤(6-MP)，产生强烈的细胞杀伤作用。在PNP基础上又构建出的多种新型自杀基因系统，包括PNP/氟达拉滨(fludarabine)系统、PNP/6-甲基嘌呤(MeP)系统

16、等。研究显示，PNP/fludarabine系统较HSV-TK/GCV系统具有更强的旁观者效应。Krohne等以腺病毒为载体，将PNP/fludarabine和HSV-TK/GCV分别转染人肝癌细胞株，结果显示，在p53(+)肝癌细胞株中，PNP/fludarabine和HSV-TK/GCV两系统的疗效相当，而PNP/fludarabine在诱导细胞凋亡的早期能够迅速诱使大量癌细胞死亡；在p53(-)肝癌细胞株中，PNP/fludarabine明显优于HSV-TK/GCV，因为前者是不依赖p53和Fas/Fas配体系统诱导细胞凋亡的。而Cai等的研究也显示，PNP/MeP系统具有显著的旁观者效

17、应，从而产生明显的抗肿瘤作用。目前，单一自杀基因的临床疗效尚不能令人满意，因此人们开始构建融合自杀基因，即两个作用机制不同的自杀基因用连接子或直接连接，使用一个开放阅读框，转录翻译产生一个嵌合的双功能融合蛋白。由于目前HSK-TK/GCV和CD/5-Fc系统的研究最广泛，技术较成熟，故双功能融合自杀基因CDglyTK成为众多学者研究的首选。已经有研究显示，CD和TK的联合给药存在相加效应，CDglyTK对肿瘤的杀伤作用较单一的CD或TK基因大，且被CDglyTK转染的细胞对放射性的敏感性大为增加。目前，CDglyTK系统在鼻咽癌、胃癌等肿瘤治疗的基础研究上均已取得了令人鼓舞的研究结果。4。、肿

18、瘤基因治疗面临的问题 近年来，载体系统的不断完善和发展，相关的基因治疗研究和试验报道层出不穷，然而真正意义上的突破却不容乐观，主要有：（1）没有十分理想的治疗基因，不同个体发生肿瘤免疫逃逸的机理可能不同，目前还没有一个公认的与癌症的发生、发展密切相关的基因。（2）体内基因传染效率较低，限制了治疗基因的表达。（3）对肿瘤发病机理的认识还远远不够。（4）导入的目的基因难以控制，肿瘤细胞的靶向性不强，损害正常细胞的功能。根据以上目前肿瘤基因治疗的研究主要集中在：（1）寻找新的更有效的治疗基因；（2）寻找更好的载体增加传染效率；（3）选择更合适的导入途径。 总之，由于肿瘤是多因素、多环节、多阶段的复杂的基因疾病，依靠单一方法并不能达到理想的抗肿瘤效果，因此多种治疗联合、针对肿瘤的不同特征进行个体治疗也已成为基因治疗发展的一个趋势5 参考文献1、 杨家驹，段振玲，肿瘤的基因治疗进展，医学综述，2005，11（10）：883-8852、 刘宾娜，肿瘤的基因治疗，牡丹江医学院学报，2007，28（5）：72-743、 沈裕康，肿瘤的基因治疗，上海医药，1999，20（9）：11-13