第4章---生物物理技术-细胞实验技术.doc

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1、第4章 细胞实验技术摘要： 细胞生物学的重要性及其在生命科学中的重要地位已被科学家们所公认。2002年第6916期Nature杂志的封面赫然写着Cell Biology is a big science。1925年细胞生物学的先行者E.B.wilson在其不朽著作细胞的发育与遗传中指出“每一个生物学问题的关键最终必然从细胞中寻求”D.L.斯佩克特,2001。本篇细胞实验技术主要包括以下内容：细胞培养 (Cell culture)，细胞(电)融合（Electrofusion），细胞电穿孔（Electroporation），离心分离技术(Centrifugation)，流式细胞计量术(Flow c

2、ytometry)，微流孔芯片(Microchannel, Lab-on-chip)，显微切割 (Laser capture microdissection)细胞电泳 (Cell Electrophoresis)，细胞/组织芯片技术（Cell/tissue microarray/Cell），细胞放射自显影术（Cell autoradiograph），细胞的显微注射技术（MicromanipulationTechnique）。本章主要讲述以上11种技术的原理及应用，并附有图片加以形象说明。目录1细胞培养(Cell culture)21.1基本概念21.2 培养细胞的特性31.3培养细胞生长的条件

3、31.4细胞传代31.5细胞冻存和复苏42细胞电融合42.1概念42.2细胞电融合过程及其优点42.3应用43 细胞电穿孔（Electroporation）53.1概念53.2应用54 离心分离技术(Centrifugation)64.1概念64.2 差速离心 （Differential centrifugation）64.3 密度梯度离心75 流式细胞计量术(Flow cytometry)85.1流式细胞仪分选原理及结构85.2流式细胞的应用85.3流式细胞在测定细胞凋亡和周期中应用86 微流孔芯片(Microchannel, Lab-on-chip)96.1概念96.2微流控芯片技术在细胞

4、学中的应用97 显微切割 (Laser capture microdissection)107.1 概念107.2 切割及细胞采集方法107.3微切割的应用118 细胞电泳(Cell Electrophoresis)118.1概念118.2单细胞凝胶电泳(singlecellgelelectrophoresisSCGE)，又称彗星试验(comet assay)129 细胞/组织芯片技术（Cell/tissue microarray）139.1概念139.2芯片简介139.3芯片技术主要环节149.4芯片技术的应用1410细胞放射自显影术（Cell autoradiograph）1410.1原理

5、1410.2应用1411 细胞显微注射技术（MicromanipulationTechnique）1511.1概念1511.2显微注射的特点1511.3常用仪器1511.4应用实例161细胞培养(Cell culture)1.1基本概念1.11 细胞培养：将动、植物细胞或组织从机体内取出分散成单细胞悬液，给予必要的生长条件，让其在培养基上继续生长繁殖的过程。原代培养：从机体取出后立即进行的细胞培养。1.12传代培养：原代培养的细胞在生长一定时间以后，就会由于营养成分的消耗、代谢产物的积累以及接触抑制等因素而停止生长，因此必需将细胞传到新的培养瓶中去使其继续生长。1.13细胞系：由细胞株传至50

6、代后又出现危机不能再传下去，但是如果有部分细胞发生了遗传突变就有可能在体外培养的条件下无限制地传下去。这些细胞具有癌细胞的特点，这种传代细胞称为细胞系。细胞系的特点是染色体发生明显变化，失去接触抑制的特性。 图1.1实验室中几种常用的细胞系：兰容,et al,2007 正常细胞 凋亡细胞 分裂中期细胞 图1.2 传代培养的绍鸭成纤维细胞形态（DAPI染色)兰容,et al,20071.2 培养细胞的特性1.21培养细胞的生长方式 贴附生长：必须贴附于支持物表面才能生长。见于实体瘤细胞。 悬浮生长：于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。见于各种造血系统肿瘤细胞。1.22培养细胞的生长特点

7、a. 贴附：贴附并伸展，是多数体外培养细胞的基本生长特点。b. 接触抑制及密度依赖性（80%传代）（见下图1.3） 图1.3 细胞培养1.23细胞培养的生长过程a. 原代培养或初代培养期: 取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养(14周)。b. 传代期: 细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种至两个或者更多的培养器皿中(数天到一周左右)。c. 衰退期: 在此期间细胞开始时虽仍然存活，但生殖已经很缓慢并逐渐完全停止，进而细胞发生衰亡、死亡(传代3050次以后)。1.3培养细胞生长的条件1.31细胞的营养需要 a基本营养物质：氨基酸、维生素、碳水化合物及一些无机离子

8、b促生长因子等物质 c此外激素也可有助于细胞生长1.32细胞的生存环境 a温度: 适宜的温度与取材的动物种类有关 b气相及pH:一般气体环境为95%空气加CO2的混合气体.pH: 7.2-7.4 c渗透压 d无污染及无毒：无毒是培养细胞的必须条件。1.4细胞传代1.41细胞传代方法 根据细胞生长恃点，传代方法有3种。 a 悬浮生长细胞传代 b 半悬浮生长细胞传代（Hela细胞） c 贴壁生长细胞传代 采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25的胰蛋白酶液。1.42贴壁生长细胞传代方法 a 吸光培养瓶中的培养液, PBS冲洗两次。 b 加入0.25的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准）静置2-

9、10 min（显微镜下动态监测）。 c 当贴壁细胞周边变圆时，加入培养液中和胰酶（等体积）。 d 用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液。 e 吸取1/101/40细胞悬液，接种于新的培养瓶内。 f 加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内。 g 将后者放入培养箱中培养。1.5细胞冻存和复苏1.51细胞冻存方法 (预先配制冻存液： 含20%血清培养基 10% DMSO )a 消化细胞，将细胞悬液收集至离心管中。b 1000rpm离心10分钟，弃上清液。c 沉淀加入含保护液的培养液,计数,调整至5106/ml左右。d 将悬液分至冻存管中，每管1 ml。e 将冻存管口封严。如用安

10、瓿瓶则火焰封口，封口一定要严，否则复苏时易出现爆裂。f 贴上标签，写明细胞种类，冻存日期。冻存管外拴一金属重物和一细绳。g按下列顺序降温：室温4（20分钟）冰箱冷冻室（30分钟）低温冰箱（30 1小时）气态氮（30分钟）液氮。1.52细胞复苏方法a从液氮中取出冷冻管，迅速投入3738 水浴中，使其融化（1分钟左右）。b打开冻存管，将细胞悬液吸到离心管中。c 1000rpm离心10分钟，弃去上清液。d沉淀加10ml培养液，吹打均匀，再离心10分钟, 弃上清液。（细胞数量少的情况下，复苏时可省略步骤4。）e加适当培养基后将细胞转移至培养瓶中，37培养，第二天观察生长情况。D.L.斯佩克特,2001

11、2细胞电融合2.1概念细胞融合(cell fusion)是指两个或多个细胞通过质膜融合形成单个双核或多核细胞的现象称为细胞融合,结果产生杂交细胞(hybrid),亲本相同的融合细胞称为同核体(homokaryon),反之称为异核(heterokaryon).当细胞置于非常高的电场中，细胞膜就变得具有通透性，能让外界的分子扩散进细胞内，高强度电场脉冲也能引起细胞融合，这一现象叫做电融合。Zimmermann,et al.1980图2.1是在体细胞核移植克隆多莉过程中用到的细胞融合途径。 图2.1 体细胞核移植克隆多莉过程图2.2细胞电融合过程及其优点将悬浮细胞在低压交流电场（100200v/cm

12、）中聚集成串珠状细胞群，或将培养细胞形成单层接触，然后加高压电脉冲（11.8kv/cm, 脉冲宽0100s），导致胞间细胞质沟通，造成细胞融合。其优点有：效率高；杂交频率高，为PEG法的100倍；操作方便，对细胞无毒害作用；可在显微镜下操作.2.3应用如图2.2所示。 图2.2 细胞电融合的应用实例 Neumann,et al.1982 3 细胞电穿孔（Electroporation） 3.1概念 当细胞置于非常高的电场中，细胞膜就变得具有通透性，能让外界的分子扩散进细胞内，这一现象被称为电穿孔。汪和睦,2000 因为细胞膜随后必须重新愈合，以使细胞复原，所以外界电场只能以间歇方式也就是脉冲方

13、式进行。 有人证明用振荡电场脉冲进行电穿孔有更高的效率。 3.2应用 运用这一技术，许多物质，包括DNA、RNA、蛋白质、药物、抗体和荧光探针都能载入细胞。 作为一种基因转导方法，电穿孔已被广泛用于各种细胞类型，包括细菌、酵母、植物和动物细胞。Simon, J. R.1993图3.1酵母细胞的电穿孔图3.2电穿孔的应用4 离心分离技术(Centrifugation)4.1概念 离心技术是利用不同物质之间的密度等差异，用离心力场进行分离和提取的物理分离分析技术，广泛用于生物学、医学、农学、化学、化工等领域。赵立新,et al.20064.2 差速离心 （Differential centrifu

14、gation）4.21特点：介质密度均一；速度由低向高，逐级离心。4.22用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器。4.23沉降顺序：核线粒体溶酶体与过氧化物酶体内质网与高基体核蛋白体。可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯度离心再进行分离纯化。下图4.1为差速离心的示意图。赵立新, et al.2006图4.1差速离心分离细胞器成分4.3 密度梯度离心 用介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力场的作用使细胞和细胞成分分层、分离。4.31类型：速度沉降、等密度沉降。4.32常用介质：氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖。4.33分离活细胞的介质要求： 1）能产

15、生密度梯度，且密度高时，粘度不高； 2）PH中性或易调为中性； 3）浓度大时渗透压不大； 4）对细胞无毒。4.34速度沉降 （velocity sedimentation） 用途：分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。 特点：介质密度较低，介质的最大密度应小于被分离生物颗粒的最小密度。 原理：介质密度梯度平缓，分离物按各自的沉降系数以不同的速度沉降而达到分离。4.35等密度沉降 isopycnic sedimentation 用途：分离密度不等的颗粒。 特点： 介质密度高，陡度大，介质最高密度大于被分离组分的最大密度。力场比速率沉降法大10100倍，需要高速或超速离心。 原理：样品各成分在连续

16、梯度的介质中经过一定时间的离心则沉降到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的成分分离。下图4.2为速度沉降和等密度沉降的示意图（比较）。 图4.2 Velocity (A) and Equilibrium (B) sedimentation5 流式细胞计量术(Flow cytometry)流式细胞术(FCM)定义：FCM是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的技术。Nunez,R.20055.1流式细胞仪分选原理及结构5.11工作原理： FCM是一种在计算机技术支持下的高度自动化的细胞显微 荧光脉冲分光光度仪。 5.12基

17、本组成结构a、液流系统 样品流和鞘流b、光学系统 激光、透镜组、光电倍增管等。c、数据处理系统下图5.1是流式细胞仪的示意图。M.A.van Dilla et al，1985图5.1流式细胞仪原理示意图5.2流式细胞的应用a、淋巴细胞及其亚群的分析b、淋巴细胞功能分析c、白血病免疫分型d、肿瘤耐药基因分析f、在AIDS病检测中的分析g、自身免疫性疾病相关HLA 抗原分析5.3流式细胞在测定细胞凋亡和周期中应用下图5.2是细胞周期分析样品曲线。A为正常培养细胞用DAPI染色后的周期分布；BWEI S期和G2期的增长；C为G2期停滞图5.2 细胞周期分析样品曲线 下图5.3是在使用FAS单抗诱导前

18、后的检测结果。图片由SUNBIO生命科学实验中心数据库提供.横坐标是Annexin-V FITC, 纵坐标是PI，左上、右上、左下、右下四个象限中右上象限代表死亡的细胞，左下象限是存活的细胞，右下象限是凋亡的细胞。图5.3 流式细胞仪检测凋亡细胞6 微流孔芯片(Microchannel, Lab-on-chip)6.1概念 微流控芯片是以微管道为网络连接微泵、微阀、微储液器、微电极、微检测元件等具有光、电和流体输送功能的元器件，最大限度地把采样、稀释、加试剂、反应、分离、检测等分析功能集成为一体的微全分析系统。它已成为目前分析仪器发展的重要方向与前沿。微流控芯片的出现不仅可使珍贵的生物试样与试

19、剂消耗大大降低到微升甚至纳升级，而且使分析速度成十倍百倍地上升，从而为分析测试技术普及到千家万户创造了条件。林炳承,et al.2008图6.1 微流控芯片的制备6.2 微流控芯片技术在细胞学中的应用（1） 细胞操纵（2） 细胞培养（3） 单细胞检测（4） 其他应用6.21磁力操纵法 磁力操纵常采用免疫磁珠。 原理：特定的细胞表面抗原能与包被在磁珠上的特异性抗体结合，在外加磁场作用下，含有特异性抗原的细胞被吸附而滞留在磁场中，而没有该种表面抗原的细胞则不能与抗体结合，没有磁性，不能在磁场中停留，从而使不同的细胞得到分离。6.22细胞培养 微流控芯片具有相对封闭的多维网络结构，通道尺寸与细胞尺寸

20、相当，而且芯片制作材料众多、结构设计灵活多样，因而越来越多地应用于细胞培养。 在微流控芯片上进行细胞培养的常用方法是灌流式培养，是指将细胞悬液注入微通道或者微培养室，待细胞贴壁后，将培养液连续灌入培养区域，实现营养物质的连续更新。6.23单细胞分析林炳承,et al.2008图6.2用激光镊子和介电电泳操控的单细胞分离微芯片7 显微切割 (Laser capture microdissection)7.1 概念 显微切割（Laser micro-desection）就是在显微镜下用手工或仪器采样的方法从组织切片或细胞涂片上将所要研究的形态或表型相同的细胞从组织三维构造中分离出来，获得纯的细胞群

21、（pure cell population），以备进一步作分子水平的研究。 微切割技术的贡献就是克服了组织的细胞成分非常繁杂这一重大的缺点。黄国韦,20097.2 切割及细胞采集方法 微切割及细胞采集方法大体上可分为手工操作和仪器操作两大类。两者各有长短。从两个方面评价这些方法，一是准确性，即有无杂细胞污染；二是它的效率，能否在较短时间内采集到足够的细胞；当然也要考虑方法所需费用。 （1）手工操作 就是用消毒的细针或刀片搔刮组织切片（厚515m）上的细胞，并将其移至Eppendorf管中。 （2）仪器操作 利用激光进行微切割和细胞采集，其特点是微切割的精度高，可进行单个或几个至数十个细胞的切割

22、，可获得很纯的细胞群体，并适用于各种组织材料；再就是效率极高，整个过程仅需23min或数sec，但仪器价格昂贵。具体又有4种不同的方法：激光微光束微切割 激光加压弹射 贴于膜上的原组织微切割 激光俘获微切割。 下图7.1为激光微切割的示意图。黄国韦,2009图7.1 微切割过程示意图7.3微切割的应用a细胞基因突变及微卫星变异的研究 b细胞基因拷贝数的变化和甲基化水平的检测c定量RT-PCRd比较基因组杂交ecDNA微阵列（芯片）8 细胞电泳(Cell Electrophoresis)8.1概念 在一定PH值下细胞表面带有净的正或负电荷，能在外加电场的作用下发生泳动，这种现象称为细胞电泳（ce

23、ll electrophoresis）。 引起细胞电泳的电位值称为电位。各种细胞或处于不同生理状态的同种细胞荷电量有所不同，故在一定的电场中的泳动速度不同。在恒定的电场条件下，同种细胞的电泳速度相当稳定，因而可通过测定电泳速度来推算出细胞的电位。 电位常因细胞生理状态和病理状态而异，因此在诊断疾病上有一定价值。此外由于不同类型的细胞在电场中的泳动速度不同，细胞电泳尚可用来分离不同种类的细胞，例如可把淋巴样细胞与造血细胞分开。8.2单细胞凝胶电泳(singlecellgelelectrophoresisSCGE)，又称彗星试验(comet assay)8.21单细胞凝胶电泳(singlecell

24、gelelectrophoresisSCGE)又称彗星试验(comet assay)是近年来由ostling建立，经singh等改进的用于检测有核细胞DNA损伤的技术，可在单个细胞水平上检测DNA损伤和修复。田云,et al.20048.22 基本原理 在细胞裂解液的作用下，有核细胞的生物膜破坏，使细胞内的DNA、蛋白质及其他成分进人凝胶，继而扩散到裂解液中，唯核DNA仍附着在剩余的核骨架上而留在原位。DNA解螺旋后进行电泳，如细胞未受损伤，则核DNA断片较少，片段较大，电泳时DNA因其分子质量大而停留在核基质中，经荧光染色后呈圆形的荧光团无拖尾现象;若细胞受损，DNA断片较多，在碱性条件下D

25、NA解螺旋变为单链，电泳时因DNA分子量小可以进人凝胶中，向阳极伸展，荧光显微镜下呈一个亮的头部和尾部，形似彗星，故又称彗星实验。8.23实验步骤彗星实验的实验maggierwm,2008步骤如下图8.1所示：图8.1 彗星实验的实验步骤8.24 彗星检测及分析 maggierwm,2008 没处理过的细胞 处理过的细胞 图8.2 彗星实验的结果碱性电泳条件为33v/300mA 15分钟。上面有图所见明显彗尾就是DNA损伤状态.图8.3彗星实验的图片定量化分析8.25图片定量化分析maggierwm,2008如图8.3所示，DNA损伤的结果衡量使用衡量“彗头”“彗尾”的位置来进行的。尾部瞬间与

26、尾部的DNA百分比含量是用来分析结果的重要参数，样本中至少应该分析50-100个细胞，在样本中，尾部瞬间图应该在DNA损伤的图中被标注出来，这样DNA损伤可以与DNA的遗传物质迁移进行对比，然后来计算结果。彗星DNA的含量%=彗星DNA的光密度/细胞DNA的光密度。.9 细胞/组织芯片技术（Cell/tissue microarray）9.1概念 生物芯片（Biochip或Bioarray）是指包被在固相载体上的高密度DNA、抗原、抗体、细胞或组织的微点阵(microarray）。 生物芯片包括DNA芯片、抗原芯片、抗体芯片、细胞芯片、组织芯片等。马立仁,20029.2芯片简介下图9.1为细胞

27、芯片的全过程图。Narayanaswamy et al. Genome Biology 2006 7:R6 doi:10.1186/gb-2006-7-1-r6图9.1细胞芯片An overview of spotted cell microarrays. (a) Cell chips are constructed using slotted steel pins to print cells robotically from 96-well plates onto poly-L-lysine or Con A/Mn2+/Ca2+-coated glass slides. The sampl

28、e image shows arrayed yeast cells immunostained for tubulin using fluorescein isothiocyanate(FITC)-conjugated-goat anti-rat IgG/rat anti-tubulin (red), overlaid on a bright field image and a DAPI-stained image (blue) of the cells nuclei. FISH, fluorescence in situ hybridization. (b) Wide-field light

29、 scattering image of a cell microarray (approximately 2 cm 6 cm) containing around 4,800 viable, haploid yeast deletion strains. The bright dots arise from light scattered when scanning the array with a Genepix DNA microarray scanner. Spots are around 200 m in diameter, separated by 410 m. (c) Close

30、-up of a typical spot from the microarray showing distinct cells at 40 magnification. This image was taken immediately after printing, so growth medium (YPD, 17% glycerol, 200 mg/l G418) is still visible. Narayanaswamy et al. Genome Biology 2006 7:R6 doi:10.1186/gb-2006-7-1-r6组织芯片的应用如下图9.2.图9.2 组织芯片

31、的应用组织芯片的特点：高度并行性：提高实验进程、利于显示图谱的快速对照和阅读。多样性：可进行样品的多方面分析，提高精确性，减少误差。微型化：减少试剂用量和反应液体积，提高样品浓度和反应速率。自动化：降低成本，保证质量。9.3芯片技术主要环节芯片制备：微点阵。样本制备：DNA提纯、扩增、标记。杂交：样本与互补模板形成双链。检测：共聚焦扫描，双色激光。数据处理：定量软件，数据库检索，RNA印迹等。邢婉丽,20069.4芯片技术的应用基因表达分析：肿瘤。基因突变检测：遗传性疾病。测序、基因图绘制和多态性分析：测序。微生物菌种鉴定：毒力基因、抗药基因。药物研究：新药筛选、指导合理用药。克隆选择及文库筛

32、选邢婉丽,2006。10细胞放射自显影术（Cell autoradiograph）10.1原理 放射性核素在蜕变过程中发出带电粒子可使感光材料感光。利用这样的特性，用放射性化合物脉冲标记活细胞,经固定、切片后在暗处把感光乳胶覆盖于切片上,在此期间,由于放射性同位素衰变使乳胶曝光,经显影、定影,根据银粒所在部位,就可知道细胞中放射性物质的分布。DU Ming-hua,et al.200610.2应用 用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用机理、作用部位等等。 一般用14C和3H标记。常用3H-TDR来显示DNA，用3H-UDR显示RNA；用3H氨基酸研究蛋白

33、质，用3H甘露糖、3H岩藻糖研究多糖。14C半衰期为5730年，3H为12.5年。下图10.1是帕金森病大鼠模型多巴胺转运蛋白(125)I-CIT放射自显影研究中的结果图。Kaufman MJ,et al，2000 图10.1 帕金森病大鼠模型多巴胺转运蛋白放射自显影研究表明：锁骨下动脉狭窄达90%。11 细胞显微注射技术（MicromanipulationTechnique）11.1概念 显微注射法（microinjection）是利用管尖极细（0.1至0.5m）的玻璃微量注射针，将外源基因片段直接注射到原核期胚或培养的细胞中，然后藉由宿主基因组序列可能发生的重组（rearrangement

34、）、缺失（deletion）、复制（duplication）或易位（translocation）等现象而使外源基因嵌入宿主的染色体内。 这种显微注射术的程序，需有相当精密的显微操作设备，制造长管尖时，需用微量吸管拉长器（micropipettepuller），注射时需有固定管尖位置的微量操作器。这种技术的长处为任何DNA在原则上均可传入任何种类的细胞内。此法已成功运用于包括小鼠、鱼、大鼠、兔子及许多大型家畜，如牛、羊、猪等基因转殖动物。肖文伍,et al.200211.2显微注射的特点优点：转染效率较高，可用于稳定转染和瞬时转染。缺点：在导入DNA 时需要一个细胞一个细胞地注射，不适合大量转染

35、细胞研究的需要。适用于制备转基因动物。11.3常用仪器 图11.1微注射仪 图11.2 细胞质显微注射图11.3 显微注射用于转基因小鼠11.4数字化细胞微注射仪11.4应用实例目前最常用来生产转基因动物的方式为：直接把重组过的 DNA 注入授精卵的原核(pronuleus) 中，将从胚胎提供者的输卵管中取得的授精卵移到倒置显微镜上的微量注射台上，然后利用固定吸量管 (holdingpipette) 固定住，之后注射针则依序穿过 zona pellucida，ocyte membrane 及malepronuleus membrane后，将 DNA注入，注入时可以见到原核膨大。以小鼠受精卵雄原

36、核的显微注射为例，如图11.5所示。Louis Marie Houdebine，2000 图11.5转基因小鼠的过程 图11.6 转基因羊的过程参考书目：1. Biophysical methods；Lakey J.H.;et al. Current Opinion in Structural Biology, 2000, 10(5)：505-506.2. Neumann, E., Schaefer-Ridder, et al. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EM

37、BO J,1982;1:841845.3. Zimmermann, U., Vienken, J., Scheurich, P., Electric field induced fusion of biological cells. Biophys. Struct. Mech 1980, 6 (Suppl.), 86. 4. DU Ming-hua, JIA Peng, Zhong Ying, Wang Xi-hai, YANG Tian-ming, JU Sheng-hong. Experiment research of autoradiogam by (99)Tcm-TRODAT-1 i

38、n Parkinson disease models rat. Journal of Medical Postgraduates,2006,03.5. Simon, J. R. Transformation of intact yeast cells by electroporation. Methods Enzymol,1993;217: 478483.6. Louis Marie Houdebine.Transgenic animal bioreactors.Transgenic Research 9: 305320, 2000.7. 刘鼎新,吕证宝.细胞生物学研究方法与技术(第二版)，北

39、京医科大学出版社,1997.8. D.L.斯佩克特著，黄培堂译.细胞实验指南.科学出版社,2001.9. 马立仁编.生物芯片.化学工业出版社 第二版2002.10. 赵立新,李枫编著.离心分离技术东北林业大学 2006.11. （瑞士）努纳兹（Nunez,R.）著,刘秉兹,许增禄 主译.流式细胞术原理与科研应用简明手册.化学工业出版社2005-8-1. 12. 郭云良，谭兰，陈燕 主编医学生物学技术与原理中国海洋大学出版社2009-6-1 .13. 邢婉丽，程京生物芯片技术实验教程清华大学出版社2006. 14. 林炳承, 秦建华 著图解微流控芯片实验室 科学出版社2008年9月.15. 田云,卢向阳,易克,何小解,黄成江,许亮. 单细胞凝胶电泳技术. 生命的化学,2004，24（1）：16. 汪和睦.细胞电穿孔电融合电刺激原理技术及应用. 2000.17. 黄国韦.激光显微切割技术在实验教学中的介绍. 赤峰学院学报(自然科学版), 2009，06. 18. 肖文伍,王芙蓉,张苏明,赵浩斌,郑新明,樊俊华,魏庆信,张旻. 用显微注射法建立转bcl-x_l基因小鼠. 中国神经科学杂志, 2002, (03) ：630-633. 19. 兰容 周珍辉 章静波.细胞培养技术.化学工业出版社2007年8月.20