一株脱氮光合细菌的分离、筛选及性能研究.doc

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1、毕业设计（论文）中文摘要一株脱氮光合细菌的分离、筛选及性能研究摘 要：为了解决食品厂污水处理问题，本实验筛选出一株可高效脱氮的光合细菌来降解污水。从自然界及市售光合细菌液中分离出数株光合细菌，将其接种到自制模拟废水中，测定其去除总氮能力，选取去除率最高的一株光合细菌，测定其去除总磷、氨氮、化学需氧量的能力，并对其进行形态观察。结果表明，用筛选到的光合细菌SY-7降解模拟废水，总氮去除率为67.99 %，氨氮去除率为58.20 %，总磷去除率为35.91 %，化学需氧量去除率为45.37 %；SY-7经革兰氏染色结果为阴性，短杆菌，大小为（0.51.0）（1.03.0）m,液体纯培养物为粉红色，

2、平板菌落为圆形，橘黄色。关键词：光合细菌；富集；分离；脱氮率；形态观察毕业设计（论文）外文摘要Isolation and characterization of a denitrifying photosynthetic bacteria strain Abstract: The purpose of my experiment was to get a photosynthetic bacteria strain with high ability of denitrification and to provide technical information for application

3、of photosynthetic bacteria in the cleaning of sewage from food plant. Several strains of photosynthetic bacteria were isolated from nature and merchant photosynthetic bacteria product. They were used to treat home-made simulated sewage and the ability of denitrification was tested. Finally one strai

4、n of photosynthetic bacteria with highest denitrification capability was selected and observed, then its ability of eliminating total phosphor, ammoniacal nitrogen and chemical oxygen demand(COD) was also tested. The result showed that the selected photosynthetic bacteria SY-7 moved 67.99 % of total

5、 nitrogen, 58.20 % of ammoniacal nitrogen,35.91 % of total phosphor and 45.37 % of COD. SY-7 was belong to brevibacterium and Gram-negative. Its size is （0.51.0）（1.03.0）m. The liquid culture was pink and the colony was round and saffron yellow.Keywords: photosynthetic bacteria; concentration；selecti

6、on；the rate of denitrification；morphology observation 目 录1 绪论11.1 光合细菌概述11.2 光合细菌在各个领域的应用及国内外研究现状31.3 本研究的目的及意义52 材料与方法62.1 材料62.2 主要实验仪器82.3 方法83 结果分析113.1 光合细菌的富集113.2 光合细菌的分离123.3脱氮光合细菌的筛选123.4 SY-7光合细菌形态特征观察164 讨论18结论20致谢21参考文献22淮海工学院二0一一届本科毕业设计（论文） 第 23 页 共 23页1 绪论1.1 光合细菌概述光合细菌 ( PSB)是自然界中广泛存在

7、的比较古老并具有原始光能合成体系的原核生物, 属于水圈微生物的一种，在自然界分布极广，几乎遍布于土壤、泥炭、 沼泽、淡水、海水、水生植物根系，甚至在90的温泉、冰天雪地的南极海岸、 以及含30%盐的水体中也能找到它的踪迹，它是地球上物质和能量循环中不可缺少的一大类群微生物。因其细胞内具有细菌叶绿素和类胡萝卜素，常使用光合细菌自下而上的水体或固体呈现出红色。PSB是生命演化中的过渡类型, 具有多种生理功能, 代谢类型极为多样, 有光能自养、异养和混养多种营养生长方式, 具有光合、固碳、降解大分子有机物、固氮、脱氮、硝化、反硝化、硫化物、氧化等代谢方式,在养殖用水、有机废水和生活污水的净化处理中显

8、示出其强有力的优势1。1.1.1 光合细菌的分类根据在光合作用中是否产生氧气，可将光合细菌分为产氧光合细菌和不产氧光合细菌两大类。其中蓝细菌为产氧光合细菌的代表；不产氧光合细菌主要包括外硫红螺菌科、着色菌科、绿色硫细菌、紫色非硫细菌、多细胞丝状绿细菌、螺旋杆菌科、含细菌叶绿素的专性好氧菌等7大类群50个属2。1.1.2 光合细菌的形态学特征光合细菌都是革兰氏阴性菌, 其形态多样，有球状、杆状、螺旋状、弧状、卵状、环状、半环状、丝状, 也可以随着培养条件、生长阶段以及菌种的不同变为链状、 锯齿状、格子状、网球状等；球状细胞的直径一般为0.3-0.6 m, 杆状为0.5-1.0 m0.9-2.0

9、m,螺旋状细胞通常为0.7-1.0 m 3-5 m；在运动方面有通过鞭毛运动的, 有滑行运动的,或者不运动的；主要以二分裂方式进行繁殖, 少数为出芽生殖；一般没有形成芽孢的能力3。光合细菌体内没有叶绿体和类囊体, 但是具有双层膜的类似叶绿体的结构, 在此结构中有类似于植物叶绿素a的光合色素, 即细菌叶绿素, 有的还有大量的类胡萝卜素。因此PSB会呈现出一定的颜色，一般而言，红螺菌科和着色菌科的种类呈红色、粉红色、紫色或茶褐色，这是因为其类胡萝卜素的高浓度蓄积，掩盖了细菌叶绿素的颜色；绿菌科的种类呈绿色。那些类胡萝卜素含量较少的种类或缺少类胡萝卜素的变异株便显示出细菌叶绿素的颜色4。1.1.3

10、光合细菌的生理特性1.1.3.1 代谢方式光合细菌有独特的生理代谢功能，在光照条件下，能利用低级脂肪酸、多种二羧酸、醇类、糖类、芳香族化合物等低分子有机物作为光合作用的电子供体进行光能异养或光能自养生长；在微好氧或黑暗好氧条件下，它们又能以各种终端电子受体（O2、硝酸盐或有机物）进行异养或自养生长,随环境条件的变化改变其获得能量的方式，改变自身的代谢方式5。1.1.3.2 最适生长条件光合细菌在10 45 范围内均可生长繁殖，最佳温度在30 40 ；适合绝大多数光合细菌生长的最佳pH值范围在7.0-8.0之间；钠、钾、钙、钴、 镁、 铁等是光合细菌生理代谢中的必需元素6。 1.1.3.3 能量

11、获取形式光合细菌的获能形式有三种：一是通过光合作用获得能量。只要供氢体和碳源合适，所有光合细菌都能在光照、厌气条件下 ,通过光合磷酸化获得能量；二是通过脱氮或发酵获得能量 ,这是在厌气、黑暗条件下进行的,由有机酸产生能量，或在反硝化过程中从有机物放出能量；三是通过呼吸作用获得能量 ,这是在有氧、黑暗条件下进行的,从有机物的氧化磷酸化中取得能量。PSB在利用光能进行光合反应时，因用于还原的CO2供氢体不同，其反应式可分为三类：第一类以硫代硫酸盐为供氢体，第二类以硫化氢为供氢体，第三类以有机物为供氢体4。1.1.4 光合细菌的生态特征1.1.4.1 光合细菌的生态位光合细菌主要生存于水域中厌氧层上

12、部，可以下层的硫酸还原菌和细菌发酵生成的硫化氢、二氧化碳为营养源进行光合作用，转换成其自身化合物，其中一部分又还原回到厌氧层。从另一个角度讲，可以说光合细菌阻止在厌氧层生成的物质移向好氧层，光合细菌在此起着生物滤器的作用，可阻止厌氧层生成的毒性物质硫化氢扩散到好氧层，使生活于好氧层中的水生生物、水生动物和水生植物得以正常生长繁殖7。1.1.4.2 光合细菌在氮元素循环中的作用光合细菌大多数种类能产生固氮酶而具有固氮能力。近年来的研究还发现光合细菌的某些种类具有脱氮活性，如Rhodobacter sphaeroides S株，当有硝酸盐存在时，能在缺氧的条件下将其还原成氮气。因此，在利用其处理高

13、浓度有机废水时，不仅能高效地去除BOD，同时还兼有良好的除氮效果。1.1.4.3 光合细菌对高浓度磷酸盐的去除据研究，红螺菌科的某些种类对磷酸盐的耐受性很强。如球形红杆菌在磷酸盐浓度高达50 mM的培养基中仍能良好生长，实验研究还表明，该菌能在一定条件下能大量积累多聚磷酸盐。这表明利用PSB净化水质，在去除BOD的同时，可以实现除磷的效果。1.1.4.4 光合细菌在硫元素循环中的作用由于光合细菌能将硫化氢、硫代硫酸盐等转化为元素硫或硫酸，因而在自然界的硫循环中占有重要位置。例如，可在水域厌氧层上部阻止硫化氢向好氧层扩散；还有，水稻从营养生长进入生殖期时，水稻根部的氧化能力增强，使根圈呈厌氧状态

14、，这时的硫酸盐还原菌迅速增殖，在水稻根际发生硫化氢以及腐胺、尸胺等积累，从而使水稻根受到损伤。如果此时光合细菌大量生长，便会除去上述有毒物质，有利于水稻的生长发育4。1.2 光合细菌在各个领域中的应用及研究现状20世纪 80年代以前, 国内外 PSB的应用主要在污水净化、水产畜牧养殖和农业增产等方面，之后由于 PSB含有丰富的营养药用成分及其独特的生物转化功能,在医药保健品方面的应用研究有了新的发展。当前在国外, PSB 已在保健食品中应用,但在国内 PSB尚未列入可用于保健食品的菌种名单内, 仅沼泽红假单胞菌已获准用于饲料添加剂。以下主要介绍PSB在污水和养殖水净化上的应用8。1.2.1 光

15、合细菌净化水质的作用机理目前, 常用于有机废水处理的光合细菌主要有红螺菌科的胶质红假单胞菌和球形红假单胞菌。这类细菌中的一些种属，其细胞中的载色体颗粒中密集地包含着细菌叶绿素和类胡萝卜素, 能够进行光合磷酸化反应和光氧化还原反应。在好氧条件下, 胞内缺少这种载色体, 但只要将其置于光照厌氧条件下,载色体就会很快形成,代谢途径迅速转化，并将有机酸异化,与同化的氧化还原反应和光氧化还原反应紧密地联结起来。光合细菌中的红螺菌既不像严格厌氧的甲烷细菌那样对氧的存在高度敏感,可以在有氧条件下分解有机物,通过氧化磷酸化取得能量供其生长；又不像好氧的活性污泥菌胶团细菌那样受污水中氧浓度的限制,可以利用光能进

16、行高效的能量代谢,即使在微弱的光照条件下也能进行,其中有机物作为供氢体被利用。这种随环境条件的变化而灵活地改变代谢类型的特性, 是光合细菌能够净化水质的主要原因9。随着光合细菌被广泛使用 ,人们发现它的生理生态功能之所以得到发挥 ,是因为有自然界中其它有益菌的帮助。生物学家的研究表明 ,自然界的有机污染物是通过微生物的协同作用达到净化目的的。首先是放线菌、芽抱杆菌、酵母菌、乳酸菌等有益菌把碳水化合物、脂肪、蛋白质分解产生低分子糖类、低级脂肪酸、氨基酸等小分子物质,然后才有光合细菌利用小分子有机物迅速增殖,并取代初级分解者的地位。这是因为光能异养型细菌能利用光能，对比其它非光能异养细菌而言，能更

17、高效且迅速的分解小分子有机物,所以其很容易成为优势菌种。随着有机残基浓度不断增加,光合细菌逐渐衰老死亡,最终由活性污泥微生物和藻类取代,将污水净化10。1.2.2 光合细菌在水产养殖业的应用在养殖过程中常因养殖对象排泄物及残饵等有机物的积累造成水体污染， NH3-N浓度高，导致水质败坏，有害菌大量生长，从而导致水产动物缺氧、生病、乃至死亡。生产上一般采用换水的解决办法，但存在一些弊端，如难以保持养殖水体适当肥度及增加养殖成本。随着水产养殖业的快速发展和集约化程度地不断提高，水源水及养殖自身污染日益加剧，为有效控制养殖水质恶化问题，而又不影响养殖产品质量，光合细菌在水产养殖业中的应用越来越广泛，

18、并日益成为发展无公害水产养殖业的优选投入品。通过施用光合细菌，利用其独特的生理特点消耗养殖水体中有机物、氨氮及硫化物等，通过反硝化作用去除水体中的亚硝酸盐等，从而促进水体中养殖对象排泄物及残饵加速分解并被光合细菌利用，大大降低水中有机质、化学耗氧量、氨氮、硫化物等含量，使溶解氧含量增加。除此之外，因光合细菌无毒、无化学残留、无副作用、无抗药性问题，能有效改善养殖生态环境，减少病害的发生，为水养殖带来了可观的经济效益。伊玉华11报道称，按日用量740 mL使用光合细菌的养虾池塘中，次日便可提高DO，连续投放2天后，DO由使用前的5.7 mg/L提高到10.98 mg/L，较未使用光合细菌的池塘提

19、高DO5.4 mg/L；而氨氮含量由0.36 mg/L降至0.08 mg/L；富营养化类型的藻类数量明显下降，具有饵料价值的藻类数量增加。王梦亮等7利用沼泽红假单胞菌和类球红细菌纯培养物1:1的混合物（pH 值 7.5，活菌数1.6亿个/mL）按 30 kg/hm2用量一次性洒入鱼塘，待 PSB大量增殖并趋于稳定时，试验池水质比对照组有明显改善，其中溶解氧增加68%，COD 下降 21%，氨氮下降 58.7%，硝酸氮下降 29.4%，硫化物下降77.4%。施安辉等7分别用沼泽红假单胞菌、绿色红假单胞菌、胶质红假单胞菌和球形红假单胞菌（菌密度均在30亿个/mL以上）在室内净化污水，使用质量浓度1

20、0 mg/L，10 d 后测定COD，分别下降了9.89 % 、2.85 %、9.34 %和11.51 % ，氨氮分别下降了34.51 %、 13.33 %、 28.97 % 和18.37 %,亚硝酸盐分别下降了29.27 %、13.19 %、30.34 %和16.25 %。1.2.3 光合细菌在污水处理中的应用光合细菌在净化污水方面的卓越贡献已经得到认可，如应用到味精废水、柠檬酸废水、酒糟废水、淀粉废水、啤酒废水、豆制品废水、中药废水、养猪废水、 苯甲酸废水、生活污水、皂素废水、印染废水、焦化废水等的处理中。国内应用光合细菌法最多的是华东地区, 如上海豆制品厂、浙江轻工研究所及上海交通大学在

21、这方面有较多的研究。研究表明光合细菌不仅对多种有机物有较强的分解转化能力, 而且还耐受紫外线, 对氯、 盐分及氰、酚毒物耐性较强,可在恶劣条件下处理有机废水。有试验研究表明，光合细菌对化学需氧量（COD）为52 840 mg /L的豆制品废水处理12 h后，其去除率达92.7 %；对COD为3 860 mg /L的淀粉废水处理72 h后, 去除率达99.5 %10。1.2.4 光合细菌的发展前景二十一世纪将是生物技术全面发展、广泛应用，对人类生存产生巨大影响的世纪，而PSB则属于生物工程中最具前景的领域。随着对光合细菌研究日益深入 光合细菌在现代养殖业、农业、环保等产业中应用越来越广泛。同时，

22、关于光合细菌的开发应用还存在着诸多问题，比如：（1）光合细菌种类繁多，但进行具体研究的却是少数的几种光合细菌，这就会限制对光合细菌的利用；（2）对已知作用结果的光合细菌未能及时投入生产、创造效益或投入生产后不能充分发挥其作用等问题；因此，需要科研人员对其不断深入研究，尤其是在工艺路线以及高效菌种的分离筛选与菌种改造方面不断完善，光合细菌的应用才能更加广泛。今后这一领域的研究可能从以下几个方面进一步深入：（1）高效、多功能的优良菌种的筛选与改良；（2）利用基因工程技术构建易生产、保存、繁殖和具有优良性状的工程菌；（3）固定化光合细菌的研究与应用7。1.3 本研究的目的及意义近年来我国食品行业迅猛

23、发展，规模化程度也越来越大，除了对食品质量和卫生有了更高的要求外，对食品生产所产生的废水处理也越来越重视，食品工厂建厂时都要求规划污水处理设施。食品厂污水处理难度非常大，例如，味精生产中排放的污水量非常大，除了高的 COD外,还有高浓度氨氮、多种氨基酸和有机酸；柠檬酸生产废水中主要含有淀粉、蛋白质、各种有机酸、生产菌体所必须的酶、发酵残留物、葡萄糖、氨氮和脂肪等有机物；豆制品废水中BOD、COD 值较高,全氮和氨氮含量也较高,属于高浓度的废水。由此看出，食品厂废水中一般总氮含量较高，因此本实验以筛选脱氮能力强的光合细菌为目标13。目前废水治理系统常用活性污泥法、生物膜法和厌氧法。活性污泥法和生

24、物膜法所需的机械化程度高，维护管理复杂, 占地面积大, 而且只能用于处理低浓度有机废水；厌氧法虽能处理高浓度有机废水,但处理时启动慢，对温度要求也高。光合细菌能以多种有机酸和醇类等有机化合物作为光合作用的供氢体和碳源, 而且能耐受高浓度有机物,并具有较强的分解和去除有机物的生理特性。因此,在自然光照和微好氧条件下,能对许多高浓度有机废水进行高效率的处理, 并且在处理前不需对废水进行稀释。与活性污泥法、生物膜法和厌氧法相比，光合细菌处理法具有节约电能、水能、设备及运转费用等优点,而所得的副产品菌体污泥还可综合利用，作为鱼和家畜的饵料或种植业肥料，不造成二次污染10。所以能筛选出一株脱氮光合细菌并

25、应用到实际中，具有重要的意义。2 材料与方法2.1 材料2.1.1 菌种来源 本实验中菌种有两大来源：一是通过周边地区采样，多次富集、分离、纯化后获得；二是购买市售的光合细菌液，再经过分离纯化获得。采样地点见表1，市售菌液来源见表2。表1 采样地点编号采样地点SY1花果山水库鱼塘底泥SY2连岛在海一方沙滩沙泥SY3连岛围海造田地淤泥SY4淮海工学院污水池底泥SY5连云港市新浦某鱼塘底泥表2 市售光合细菌制剂名称及来源编号名称厂家SS1淡海水通用光合细菌广州大禹水族有限公司SS2金双喜正红A系列超级复合光合细菌天津假日渔业水族销售公司SS3光合细菌PSB晋江市奇美宠物有限公司SS4光合细菌菌种江

26、西稻草人农业园2.1.2 培养基2.1.2.1 富集培养基本实验使用了两种富集培养基，成分如下：（1）小林达治（1977）培养基13氯化铵1.0 g，氯化钠0.5-2.0 g，碳酸氢钠1.0 g，磷酸氢二钠0.2 g，醋酸钠1-5 g，七水合硫酸镁0.2 g，生长辅助因子贮液1 mL，微量金属贮液10 mL，pH 7.0，蒸馏水1000 mL。微量金属贮液配方：六水合三氯化铁5 mg，五水合硫酸铜0.05 mg，硼酸1 mg，四水合氯化锰0.05 mg，七水合硫酸锌1 mg，六水合硝酸钴0.05 mg，蒸馏水1000 mL。（2）红螺菌科富集培养基14磷酸二氢钾0.5 g，醋酸钠3 g，七水合

27、硫酸镁0.2 g，六水合氯化钙0.05 g，酵母膏0.05 g，丙酸钠0.3 g，磷酸氢二钾0.3 g，硫酸铵0.3 g，氯化钠0.1 g，pH 7.2，蒸馏水1000 mL。2.1.2.2 分离培养基14光合细菌分离培养基成分如下：酵母膏3 g，蛋白胨3 g，六水合氯化钙0.3 g，七水合硫酸镁0.5 g，pH 6.8，蒸馏水1000 mL，琼脂2 %。2.1.2.3 扩大培养基13光合细菌扩大培养基的成分如下：醋酸钠5 g，氯化铵1 g，七水合硫酸镁0.2 g，磷酸二氢钾0.6 g，磷酸氢二钾0.4 g，酵母膏0.1 g，pH 7.0，蒸馏水1000 mL。2.1.3 人工模拟废水在本实验

28、中将培养出的菌液接种到自制的人工模拟废水中，定时测定其总氮含量，从而筛选到脱氮能力强的光合细菌菌株。人工模拟废水的成分如下（g/L）：葡萄糖7.2，酵母膏1.6，磷酸二氢钾0.28，氯化钙0.36，七水合硫酸镁0.48，碳酸氢钠0.48，氯化铵1.2，一水合硫酸锰0.12，七水合硫酸亚铁0.11。2.2 主要实验仪器本实验主要使用的仪器设备见表3。表3 实验仪器名称、型号及厂家名称型号厂家紫外可见分光光度计754N上海精科立式压力蒸汽灭菌器筒01J2003-04上海东亚压力容器制造有限公司漩涡混合器XW-80A上海青浦沪西仪器厂恒温恒湿箱SPX-250C上海博迅实业有限公司医疗设备厂单人单面净

29、化工作台SW-CJ-1FD苏州净化设备有限公司高速冷冻离心机MIKRO 22R德国进口2.3 方法2.3.1 光合细菌富集（1）取20 g泥样，放于250 mL三角瓶中；（2）加入液体富集培养基200 mL，与泥样振荡混匀，液面注入0.5 cm高液体石蜡，棉塞封口，造成厌氧环境；（3）在温度30 、60 w白炽灯的生化培养箱中培养至培养液呈红色或红棕色；（4）移取红色或红棕色光合细菌的富集液1mL至装有已灭菌富集培养液5 mL的试管中，液面注入0.5 cm高灭菌液体石蜡，盖上试管盖，保持厌氧条件；（5）连续富集2-3次，使欲要分离的光合细菌成为优势种。 2.3.2 光合细菌分离（1）取富集液1

30、mL,梯度稀释至10-6；（2）选择10-4，10-5，10-6三个梯度的稀释液，涂布于分离培养基平板，涂布量为100 L；（3）将平板置于温度30 、60 w白炽灯的生化培养箱中，厌氧培养，直到出现粉色至红色的单菌落。本实验中为了制造厌氧环境，使用了两种分离方法：一是双层平板分离法；二是将涂布有稀释液的单层平板置于干燥器中，用真空泵抽去其中的空气，再充入氮气。通过这两种方法造成厌氧环境。；（4）挑取不同特征的单菌落在分离培养基平板上进行划线分离2-3次，得到纯的单菌落；（5）将分离出的单菌落接种到扩大培养基中，直至液体变为粉色至红色，得到光合细菌纯菌液。2.3.3 脱氮光合细菌的筛选在装有自

31、制模拟废水的250 mL三角瓶中，接入纯菌液，接种量为10 %，在温度30 、60 w白炽灯的生化培养箱中，厌氧培养。分别于6天、9天后以原模拟废水为基准测定其总氮含量，挑选出降氮能力最强的菌株，再测定其去除氨氮、总磷和化学需氧量（COD）的能力。2.3.3.1 总氮测定方法碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法15（1）取10.00 mL试样（含氮量超过100 g时，可减少取样量并加水稀释至10 mL），置于25 mL比色管中；（2）加入5 mL碱性过硫酸钾溶液，塞紧磨口塞，用布或绳等方法扎紧瓶塞，以防弹出；（3）将比色管置于灭菌器中，加热使温度达到120-124 后开始计时，保持此温度加热半小时；

32、（4）冷却，开阀放气，取出比色管并冷至室温；（5）加盐酸（1+9）1 mL，用水稀释至25 mL标线，混匀；（6）移取部分溶液至10 mm石英比色皿中，在紫外分光光度计上，以无氨水作参比，分别在波长220与275 nm处测定吸光度。（7）空白试验：空白试验除了用10mL无氨水代替试样外，采用上述相同步骤测定；（8）标准曲线的绘制：分别吸取0、0.50、1.00、2.00、3.00、5.00、7.00、9.00、10.00 mL硝酸钾标准使用溶液于25mL比色管中，用水稀释至10 mL，剩余步骤同（1）-（6）；（9）测得吸光度后，按下式计算：AS = AS220 - AS275Ab = Ab2

33、20 - Ab275At = AS Ab式中：AS220 、AS275分别为标准溶液在220 nm和275 nm波长的吸光度； Ab220 、Ab275分别为空白溶液在220 nm和275 nm波长的吸光度。按At值与相应的NO3N含量（g）绘制标准曲线。（10）结果表示：试样的吸光度经处理后，在标准曲线上查出相应的总氮g数，总氮含量为：c(mg/L) = m/v式中：m试样测出含氮量，g； V测定用试样体积，mL。2.3.3.2 总磷测定方法钼酸铵分光光度法16（1）消解：取试样10 mL于25 mL比色管中（若试样含磷量过高，适当减少试样体积），加入2 mL过硫酸钾，塞紧磨口塞，用布或绳等

34、方法扎紧瓶塞，以防弹出，将比色管置于灭菌器中，加热使温度达到120-124 后开始计时，保持此温度加热半小时，冷却后取出，用水稀释至25 mL标线：（2）发色：像消解液中加入0.5 mL抗坏血酸，混匀，30秒后加1 mL钼酸盐溶液，充分混匀，在室温下放置15分钟；（3）分光光度测量：移取部分溶液至10 mm玻璃比色皿中，在700 nm波长处，以水作参比，测定吸光度；（4）空白试验：空白试验除了用10 mL无氨水代替试样外，采用上述相同步骤测定；（5）标准曲线绘制：分别吸取0、0.25、0.50、1.50、2.50、5.00、7.50 mL磷酸二氢钾标准使用溶液于25 mL比色管中，用水稀释至1

35、0 mL，剩余步骤同（1）-（3），测定的吸光度扣除空白试验的吸光度后，与相应的P含量（g）绘制标准曲线（6）结果表示：试样的吸光度扣除空白试验的吸光度后，在标准曲线上查出相应的总磷g数，总磷含量为：磷酸盐（P，mg/L） = m/V式中：m试样测出的含磷量，g； V测定用试样体积，mL。2.3.3.3 氨氮测定方法纳什试剂分光光度法17（1）标准曲线的绘制：取0、0.25、0.50、1.50、2.50、3.50、5.00 mL氯化铵标准使用溶液于25 mL比色管中，加水至25 mL标线，加0.5 mL酒石酸钾钠溶液，混匀，加0.75 mL纳什试剂，混匀，放置10分钟后在420 nm波长处，以

36、水作参比，测定吸光度，扣除0号的吸光度后，与相应的氨氮含量（g）绘制标准曲线；（2）试样测定：取适量的水样（使氨氮的含量不超过50g），加水稀释至25 mL标线，剩余步骤同上；（3）空白试验：以无氨水代替水样，剩余步骤同上；（4）结果表示：试样的吸光度扣除空白试验的吸光度后，在标准曲线上查出相应的氨氮g数，氨氮含量为：氨氮（N,mg/L） = m/V式中：m试样测出的氨氮含量，g； V测定用试样体积，mL。2.3.3.4 化学需氧量COD测定方法重铬酸钾法18（1）取10.00 mL试样（或适量试样稀释至10.00 mL）置于250 mL磨口的回流锥形瓶中，准确加入5.00 mL重铬酸钾标准溶

37、液及数粒洗净的玻璃珠，连接磨口回流冷凝管，从冷凝管上口缓慢地加入15 mL硫酸-硫酸银溶液，轻轻摇动锥形瓶使溶液混匀，加热回流2小时（自开始沸腾时计时）。若废水中氯离子含量超过30 mg/L时，应先把0.2 g硫酸汞加入锥形瓶中，再加废水；（2）冷却后，用50 mL水从上部慢慢冲洗冷凝管壁，取下锥形瓶；（3）溶液再度冷却后，加3滴试亚铁灵指示剂，用硫酸亚铁铵标准溶液滴定，溶液的颜色由黄色经蓝绿色至红褐色即为终点，记录其用量；（4）空白测定：测定试样的同时，以10.00 mL蒸馏水，按上述步骤作空白试验，记录滴定空白是硫酸亚铁铵的用量；（5）结果表示：CODCr(O2，mg/mL) = ( V1

38、- V0)*c*8*1000/V式中：c硫酸亚铁铵标准溶液的浓度，mol/L； V0滴定空白时硫酸亚铁铵标准溶液的用量，mL；V1滴定试样时硫酸亚铁铵标准溶液的用量，mL； V试样的体积，mL；8氧（1/2O）摩尔质量，g/mol。2.3.4 菌液、菌落及菌体形态特征观察观察光合细菌在液体培养基中的颜色；观察其在固体分离培养基上的菌落特征；对其进行革兰氏染色，在显微镜下观察菌体形态。3 结果分析3.1 光合细菌的富集3.1.1 第一次富集为区分两种富集培养基培养出的富集液，现将其编号：小林达治培养基所得富集液编号为SY1、SY2、SY3、SY4、SY5,，红螺菌科富集培养基所得富集液编号为SY

39、、SY、SY、SY、SY。五种样品在同一种富集培养基中出现的颜色变化不同，变化出现的时间也不同；同一样品在两种不同培养基中出现的颜色变化也不同，变化出现时间也不同。第一次富集的时间为12天，10瓶富集液的颜色变化过程见表4。表4 第一次富集液在第6、9、12天的颜色变化编号6天9天12天SYI无变化出现白色絮状物无其它变化SY2无变化石蜡底层出现灰色膜液体浑浊，呈灰色SY3无变化出现灰色絮状物液体浑浊，呈乳白色SY4无变化液体呈红色液体呈深红色SY5无变化石蜡底层出现黑膜无其它变化SY无变化无变化液体呈樱桃红色SY无变化无变化液体呈暗粉色SY无变化无变化液体呈黄色SY无变化液体呈绿色，并有大量

40、红色丝状物液体呈浅褐色SY无变化石蜡底层出现灰色膜液体呈鲜红色根据各个锥形瓶的颜色变化，挑选出富集效果较好的6瓶进行第二次富集，6种富集液分别是SY4、SY、SY、SY、SY、SY。其中，SY4在第7天就呈现出微红色，逐渐加深为深红色；SY在第11天才出现浅粉色，第12天就变为浅樱桃红色；SY在第10天变为微红色，再变为粉色；SY在第11天变为浅黄色，第12天黄色加深；SY在第7天变为浅绿色，之后两天绿色加深，第10天转为红色，第12天转为浅褐色；SY在第11天变为浅绿色，第12天突然变为鲜红色。3.1.2 第二次富集将上述6种富集液再次接入到新的富集培养基中进行第二次富集，此次富集在1-4天

41、内就出现各种颜色变化，见表5。表5 第二次富集液在第3、6、9天的颜色变化编号3天6天9天SY4液体呈浅粉色液体呈深红色液体呈深红色SY液体呈深粉色液体呈深红色液体呈深红色SY无变化瓶底有大量绿色物，液体呈淡红色液体呈深红色SY液体浑浊，呈浅黄色液体呈黄色液体呈深黄色SY瓶底有很浅的粉色物液体呈红色液体呈深红色SY液体呈鲜红色液体呈深红色液体呈深红色3.2 光合细菌的分离根据第二次富集的效果，淘汰SY，将其余5种富集液稀释后，在分离培养基平板上涂布，另外将从市场上购得的4种光合细菌液SS1、SS2、SS3、SS4也经稀释后涂布，3天后菌落即长出，挑取不同特征的菌落，再进行2-3次划线分离，得到

42、单菌落。最终一共分离到37个单菌落， 其中从SY4 中分离到4个，SY中分离到6个，SY中分离到9个，SY中分离到4个，SY中分离到5个，SS1中分离到0个，SS2中分离到5个，SS3中分离到2个，SS4中分离到2个。将这些单菌落接种到液体扩大培养基中,培养成纯菌液。3.3 脱氮光合细菌的筛选将第二次光合细菌富集液和经过15天扩大培养得到光合细菌纯菌液接种到自制的人工模拟废水中，置于30 、60 w白炽灯的生化培养箱中，定时测定每组降解液的总氮含量，计算出脱氮率。3.3.1 总氮测定及降氮菌株的筛选硝酸钾溶液标准曲线见图1。图1 硝酸钾溶液标准曲线7天和14天后，测定接种富集液的模拟废水的总氮

43、含量，计算出脱氮率，见表6。表6 7天和14天后各组降解液的总氮含量和脱氮率序号7天14天含氮量(mg/mL)脱氮率（%）含氮量（mg/mL）脱氮率（%）废水0.400.40SY40.28 30.58 0.16 61.13 SY0.14 65.86 0.05 86.67 SY0.24 40.32 0.17 56.83 SY0.22 46.03 0.05 88.55 SY0.18 55.44 0.11 71.34 SS10.27 32.59 0.12 70.54 SS20.25 36.29 0.16 60.05 SS30.27 31.92 0.15 63.55 SS40.21 46.71 0.1

44、8 53.87 6天和9天后，测定接种纯菌液的模拟废水的总氮含量，计算出脱氮率，见表7。表7 6天和9天后各组降解液的总氮含量和脱氮率序号6天9天含氮量(mg/mL)脱氮率（%）含氮量（mg/mL）脱氮率（%）废水0.400.40SY4-10.2439.500.1854.37SY4-20.2343.440.1562.26SY4-30.2633.760.1853.84SY4-40.2732.690.2342.54SY-10.2440.040.2049.71SY-20.2341.470.2148.28SY-30.2439.860.2243.98SY-40.2635.730.2147.03SY-50

45、.2342.900.2245.41SY-60.2440.750.2244.87SY-10.2537.890.1953.66SY-20.2439.680.2246.13SY-30.3121.760.2244.52SY-40.2635.380.2049.71SY-50.2537.710.2244.16SY-60.2829.460.2146.49续上表序号6天9天含氮量(mg/mL)脱氮率（%）含氮量（mg/mL）脱氮率（%）SY-70.2343.080.1367.99SY-80.2341.830.1758.32SY-90.2538.420.1561.90SY-10.2243.980.2148.28SY-20.2440.040.2245.05SY-30.2439.680.2244.34SY-40.2538.060.1951.68SY-10.2732.330.2148.46SY-20.2732.150.2147.92SY-30.2830