紫杉醇药源的研究进展.doc

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1、摘 要紫杉醇是近30年来从植物中筛选出的首选抗癌药物，已被美国的FDA批准治疗晚期卵巢癌和转移性乳腺癌。紫杉醇是一种抗癌新药,紫杉醇及其衍生物还具有防治移植动脉硬化、抗瘢痕形成和抗血管生成等功能。由于资源奇缺已出现严重供给危机。本文系统地阐述了紫杉醇药用价值的开发利用和前景,并着重分析评价了国内外在紫杉醇药源开发领域的进展情况,对自紫杉醇发现以来的最新究进展进行了比较详尽的综述。主要介绍了天然抗癌新药紫衫醇的作用机理及生产途径，紫杉醇生产、应用研究存在的问题及发展前景,并总结了紫杉醇的生产方法,分析了这些方法的优点和缺点,对紫杉醇的生产方法进行了展望。目前,人们获得紫杉醇的方法主要有以下几种:

2、直接从红豆杉中提取；化学全合成；化学半合成；细胞培养；内生真菌提取培养及代谢工程生产紫杉醇；紫杉醇的生物合成。同时本文对紫杉醇的提取与分离纯化技术进行了较全面的综述。关键词：紫杉醇；药源；研究进展Recent Advances In The Research On Taxol Medicinal raw material sourcesAbstractTaxol,the first important anticancer drug screened from the plant kingdom in recent thirsty years,has been approved for the

3、 treatment of advanced ovarian cancer and metastatic breast cancer. Taxol is one of the most potent chemothe rapeutic agents known, showing excellent activity against a range of cancers. In addition to anticancer, taxol has the effect of preventing graft arterioscleriosis, antiscaring formation and

4、inhibiting angiogenesis.But the natural resources is rare.The perspectives of development and utilization of the medicinal value of taxol are systematically elaborated in this paper.Emphasis is laid on review and evaluate the latest progress in Taxol raw materials sources development. The recent res

5、earch advances on taxol, the newest weapons against cancer,have been reviewed. The article gives an overview on taxol research .In this article，the taxol，a unique crude medication against cancer was introduced.The paper mainly expatiated its effect mechanism and yield approach. Further more，the prob

6、lem of the taxol and the development perspective were discussed. It also gives prospects for the development of taxol in the future.In addition , this paper probes in a general way into the methods of producing taxol and analyzes the advantages as well as the future tendencies.There are five possibl

7、e routes to industrialize taxol production: isolation from the bark of the yew species, total synthesis, semisynthesis, tissue or cell culture, endophytic fungal fermentation and metabolism engineerin，Biosynthesis of taxol. This paper mainly also summarize extraction and isolatic purification of tax

8、ol.Key words: Taxol,Medicinal raw material sources，research advance II目 录引言1第一章 紫杉醇简介31.1 紫杉醇的研究与开发历史1.2 紫杉醇的化学结构1.3 紫杉醇的功能1.4 紫杉醇的抗癌机理第二章 紫杉醇药源的开发途径2.1 从植物来源提取紫杉醇2.1.1 直接从红豆杉植物中提取紫杉醇 2.1.2 从红豆杉近缘科属植物中提取含紫杉醇 2.2 化学合成紫杉醇2.2.1 紫杉醇的化学半合成2.2.2 紫杉醇的化学全合成2.2.3 合成或半合成紫杉醇类似物2.3 运用生物技术生产紫杉醇2.3.1 利用红豆杉植物细胞、组织

9、培养生产紫杉醇2.3.2 利用器官培养法生产紫杉醇2.3.3 利用红豆杉发根培养生产紫杉醇2.3.4 利用内寄生真菌生产紫杉醇2.3.5 利用代谢工程生产紫杉醇2.3.6 紫杉醇的生物合成 2.3.7 运用基因工程生产紫杉醇2.4 紫杉醇的提取与分离纯化技术2.5 紫杉醇生产的研究现状总结及存在的问题 2.5.1研究现状总结2.5.2 存在的问题结论参考文献谢辞 ii引 言随着全球环境的不断恶化,癌症患者不断增多。据世界卫生组织报告,近几十年来全球癌症发病率呈明显上升趋势,每年以2%3%的幅度递增。目前,全球每年新增癌症发病人数现已超过1000万,每年死于癌症的总人数达630万以上。许多年来，

10、人类一直致力于对癌症的研究，许多的抗癌药物（如阿霉素和顺铂等）也是接连不断的被创造出来。近些年来，一种新型的抗癌药-紫杉醇引起人们的广泛关注。紫杉醇(Paelitaxel，商品名Taxol)是继阿霉素和顺铂后最热点的具有独特作用机理的新型抗癌药，对许多耐常规化疗药物的肿瘤有活性。紫杉醇在肿瘤的治疗药物中代表了一类新的、独特的抗微管药物。1992年美国FDA批准紫杉醇用于晚期卵巢癌的治疗1。随着应用范围的扩大，该药需求量日益增加，药源短缺是当前的主要矛盾，国内外学者均致力于对紫杉醇的药源开发进行研究。第一章 紫杉醇简介1.1紫杉醇的研究与开发历史紫杉醇是红豆杉属（Taxus Linn，也称紫杉属

11、）植物中的一种复杂的次生代谢产物，而这类植物全世界只有11种，分布于北半球的温带至亚热带地区。因此，红豆杉（图1.1）素有“黄金植物”之称2。图1.1 红豆杉早在1856年H.Lucas就开始对欧洲红豆杉（Taxus baccate linn，浆果红豆杉）进行化学研究，但在随后的100年间没有多大进展。1958年，美国国家癌症研究所（NCI）组织化学、生态、药理及临床方面的专家发起一项历时20余年，对3 5000多种植物提取物的抗癌活性进行筛选的研究。1963年美国化学家瓦尼（M.C.Wani）和沃尔（Monre E.Wall）首次从一种生长在美国西部大森林中称谓太平洋杉（Taxus brev

12、ifolia nutt.，即Aacific Yew，短叶红豆杉）树皮和木材中分离到了紫杉醇的粗提物。在筛选实验中，Wani和Wall发现紫杉醇粗提物对离体培养的鼠肿瘤细胞有很高活性，并开始分离这种活性成份。由于该活性成份在植物中含量极低，直到1971年，他们才同杜克（Duke）大学的化学教授姆克法尔（Andre T.McPhail）合作，通过x-射线分析确定了该活性成份的化学结构：一种四环二萜化合物，并命名其为紫杉醇（Taxol）3。此后,美、日、法、德等国的药理学家和药物化学家进行了大量研究。1978年,确定了紫杉醇的剂型。1979年Horwitz等人报告紫杉醇的作用机理。1980年,进行给

13、药规程化研究。1983至1987年完成期临床试验。1987到1989年完成期临床试验。1990年以后,转入期临床试验。1992年l2月29日,美国FDA批准紫杉醇用于治疗晚期卵巢癌。1992年度,FDA共批准26个新分子产品(NMEs)。其中,有6个是世界首次上市,紫杉醇是其中之一4。1.2紫杉醇的化学结构紫杉醇(C47H51NO14), 是二萜类化合物,相对分子质量为853.9,熔点213-216,具有高度亲脂性,不溶于水。其化学名:5,20-环氧-1,2,4,7,10,13-六羟基紫杉烷-11-烯-9-酮-4, 10双乙酸酯-2-苯甲酸酯-13-酯-(2R,3S)-N-苯甲酰基-3-苯基异

14、丝氨酸酯(图1.2) 5,其基本骨架是三环二萜,含有11个手性中心。另外,C-4,C-5及C-20构成一个特殊的四元氧环(oxetane),因此,紫杉醇为一个拥有多个取代基团的6/8/6/4四环结构的化合物。从人们对taxol结构修饰与其构效关系的研究来看,其C-7,C-9与C-10位的基团以及C-11和C-12位的双键对其生物活性并无太大的影响,但是C-2,C-4位的基团以及D环和C-13位的侧链对taxol生物活性影响很大6。图1.2 紫杉醇的结构式1.3紫杉醇的功能迄今为止,紫杉醇主要用于治疗恶性肿瘤,其药效研究有扩大的趋势,但尚未进入临床应用。治疗恶性肿瘤紫杉醇及其衍生物治疗肿瘤的临床

15、试验始于20世纪80年代, 1992年美国FDA批准用于治疗卵巢癌, 1994年批准用于乳腺癌。现在主要用于治疗非小细胞肺癌、乳腺癌、胃癌、鼻咽癌、卵巢癌和宫颈癌等恶性肿瘤。紫杉醇还可调节体内免疫功能，促进白细胞介素及干扰素的释放，对肿瘤起杀伤或抑制作用，它有类似细胞内毒素脂多糖对巨噬细胞的作用，还可抑制特殊细胞的分泌功能。进一步的研究发现紫杉醇还可调节体内的免疫功能，通过作用于巨噬细胞，导致肿瘤坏死因子TNF-受体的减少以及TNF-的释放，还可促进白细胞介素IL-1及干扰素IFN-，IFN-的释放。还有研究显示紫杉醇可抑制细胞内胆固醇的运输，对正常组织细胞也可抑制其特殊功能。总之，紫杉醇是一

16、种有效治疗多种癌症的天然植物提取物，其独特的抗癌机制使之成为全球抗癌药物研究热点。2003年全球紫杉醇销售额已经超过20亿美元，并且还在以每年20%的速度递增。防治移植动脉硬化杨兆华等采用大鼠胸腹主动脉移植模型,探讨紫杉醇防治移植动脉硬化的作用,结果发现,紫杉醇可明显抑制异品系大鼠移植动脉内膜增生和炎症细胞浸润,防治移植动脉硬化,推测紫杉醇抗移植动脉硬化的作用机制不但与直接抑制平滑肌细胞的增殖有关,而且还可能与减轻受体对移植物的免疫排斥反应有关。抗瘢痕形成 任彦新等将紫杉醇应用于青光眼小梁切除术,发现术后有明显的降眼压作用, 少瘢痕形成,而且未发现对视网膜有毒性反应。抗血管生成 尹鸣等以人脐静

17、脉内皮细胞(HVV EC)为原代培养模型,通过MTT法测定紫杉醇对HUVEC增殖的影响,结果发现紫杉醇在非细胞毒浓度下具有抗血管生成作用。紫杉醇其他药效作用的研究还处在早期阶段,有待进一步深入研究。1.4 紫杉醇的抗癌机理紫杉醇的抗癌机制与其它的抗癌药不同。1979年，S.B.Horwitl等人报道了紫杉醇的作用机理，认为它属于有丝分裂抑制剂，它的独特机制在于可以诱导和促进微管蛋白聚合，使微管装配和稳定。人体的细胞形成是微管蛋白和微管蛋白形成异二聚体，它又自组装成多聚微管，形成细胞骨架结构。正常情况下，微管蛋白和组成微管的微管蛋白二聚体存在动态平衡，紫杉醇可使两者之间失去动态平衡，与紫杉醇结合

18、的微管发生形态改变，形成微管束，不与染色体连接，使细胞在有丝分裂时不能形成纺锤丝牵动染色体向细胞两极移动，使其停留在G2期和M期直至死亡，抑制了细胞分裂，达到抗肿瘤的目的。第二章 紫杉醇药源的开发途径紫杉醇是从短叶红豆杉的树皮中分离而得到的。由于该树是一种生长缓慢的矮小灌木,紫杉醇在其树皮中的含量平均为万分之一点五,提取收率平均为万分之一。因此为供试验及临床所需,大量砍伐,剥取树皮,必然破坏自然环境与生态平衡,并将导致资源枯竭。虽然后来从红豆杉的树叶部位分离到紫杉醇的前体baccatin -III(浆果赤霉素-),以供半合成紫杉醇,但紫杉醇依然供不应求,限制了对其它癌症的治疗研究。因此,为了增

19、加紫杉醇的来源,世界各国都在加紧对紫杉醇及其衍生物的开发研究。因而,长期稳定地和大量地供应紫杉醇是各国科学家们所面临的严峻挑战。长期以来科学家们为解决这一巨大供求矛盾做出了很大的努力, 其中对紫杉醇来源途径的研究处于核心地位。目前紫杉醇的药源途径主要有以下几种。2.1 从植物来源提取紫杉醇2.1.1 直接从红豆杉植物中提取紫杉醇 全世界共有11种红豆杉,我国有4种和1个变种,即东北红豆杉、云南红豆杉、西藏红豆杉、中国红豆杉及其变种南方红豆杉。除澳洲的Austrotaxus spicata产于南半球外,其余分别分布在北半球的温带至亚热带地区。人们对红豆杉植物的各部位，包括针叶、嫩枝、树皮及心材中

20、的紫杉醇含量进行了分析，发现树皮中含量最高，树叶次之.心材最低。因此从针叶中提取紫杉醇引起人们的重视。因针叶的再生力强，采集后对树的生命无太大影响，不会造成生态环境的破坏，即使针叶中紫杉醇含量较树皮稍低，但一棵树针叶中紫杉醇产量与树皮相当，因针叶的总量为树皮的24倍。多种红豆杉植物的小枝与针叶中紫杉醇含量和树皮相近，因此人们栽培大量的红豆杉植株，利用这些人工栽培植株上修剪下来的小枝条及针叶提取紫杉醇。据称用干红豆杉针叶1.8144104kg可提取紫杉醇2.5kg，因此从人工栽培红豆杉植株的针叶与小枝条提取紫杉醇，可能是方法最简便，成本最低廉的途径，其缺点是人工栽培需时较长，并且受到土地及地理条

21、件等方面的限制7。人工原料林培育规模化、集约化营造红豆杉人工原料林,是目前解决紫杉醇原料短缺的主要途径。美国BMS公司于1991年建立了红豆杉种植园,规模栽种约400万株幼苗,计划陆续再建200万株的种植园；宾西法尼亚大学国家天然产物技术开发中心已筛选出了高紫杉醇含量的植株供人工栽培,并开发了大量提取紫杉醇工艺。近年来,我国红豆杉人工种植发展迅速。据不完全统计,我国现有红豆杉种植企业140多家,现已在云南、福建、湖南、四川、黑龙江等地拥有一定规模的红豆杉种植基地,种植面积近15万亩。红豆杉人工种植对保护野生资源和满足紫杉醇制药工业的发展发挥了积极的作用。 2.1.2 从红豆杉近缘科属植物中提取

22、含紫杉醇 从化学分类学的角度分析，红豆杉科植物中含紫杉醇，其系统进化和分类相近的科属种也应含紫杉醇及同系物，值得深人研究。目前报道较多的是红豆杉属十余种植物的紫杉醇研究，红豆（Pseudotaxus chicnii)也有紫杉醇和短叶醇，不仅红豆杉科的红豆杉属、澳洲红豆杉属、白豆杉属、框树属已报道有紫杉醇及同系物，而且可以猜测穗花杉属、相邻的三尖杉科和罗汉松科植物也有紫杉醇的类似物。已有报道称:西双版纳粗榧(Cephalotaxus manii)有微量紫杉醇；高山三尖杉(C.Fortunei)、海南粗榧（C.Hainannensis）和大理罗汉松（Podocarpus forrestii)茎叶中

23、发现了紫杉醇的类似物baccatin。为紫杉醇的生物原料生产开辟了新的可能途径8。2.2化学合成紫杉醇 紫杉醇结构与药效是近年来紫杉醇化学研究最活跃的领域，通过化学结构的改造修饰，有望能获得易溶于水、抗癌活性高、毒副作用低的新型紫杉醇类似物。紫杉醇的化学合成已成为有机化学合成中的一个热点。2.2.1紫杉醇的化学半合成 紫杉醇半合成法是以红豆杉属植物中(以枝叶为主)提取分离的10-乙酰基巴卡亭-和巴卡亭-等紫杉烷类二萜化合物为前体,通过选择性保护羟基,然后在C-13羟基上接上合成的侧链,再去掉保护基团得到紫杉醇。由于10-乙酰基巴卡亭-和巴卡亭-在红豆杉属植物枝叶中含量高达0.l%以上,为紫杉醇

24、含量的10倍以上,加之红豆杉枝叶生物量大,再生能力强,半合成紫杉醇的原料是很丰富的。因而将其转化为紫杉醇的工作可以大大地改善紫杉醇的供应短缺情况。因此,半合成紫杉醇被认为是除人工种植外,扩大紫杉醇来源的有效途径。美国BMS公司、法国普朗克制药公司等紫杉醇生产的主要企业,现已利用半合成法进行工业化生产紫杉醇。 紫杉醇半合成研究与直接从植物提取紫杉醇的方法相比主要有下面两个优点:(1) 巴卡亭-和10-乙酰基巴卡亭-在植物中的含量要远远高于紫杉醇。从文献上发表的结果来看, 巴卡亭最好的提取收率要6倍于紫杉醇的最高收率。(2)半合成紫杉醇的研究可以使紫杉醇侧链具有很大的变化性。Taxotere的合成

25、就是一个很好的例子。这样就有可能在将来发现具有更强活性的紫杉醇衍生物。2.2.2紫杉醇的化学全合成 紫杉醇是分子结构比较复杂的化合物, 以Nicolaou9博士为首的美国研究小组在1994年成功实现了紫杉醇的化学全合成。现已完成6条合成路线,总结归纳起来主要有直线法、会聚法以及这两种方法(直线会聚)的联合应用。直线法以R.A.Holton和P.A.Wender为代表,会聚法以K.C.Nicolaou,S.J.Dan-ishefsky和I.Kuwajima为代表,而T.Mukaiyama则采用直线会聚联合路线，3种全合成途径都包括2540步化学反应。从总体上看,对天然药物紫杉醇的化学全合成方法路

26、径太长、合成步骤太多,不仅需要使用昂贵的化学试剂,而且反应条件极难控制,收率也偏低(最高产率不超过2% ),因此不适合工业化生产。但是,在研究紫杉醇全合成过程中发现了许多新的、独特的反应,尤其在反应过程中基团的保护以及独到的战略思路与反应创新对有机合成化学以及有机反应理论起到重要的发展和补充10。无论如何,全合成紫杉醇的研究成果仍为有机化学合成历史上的一座丰碑,同时有机合成化学家仍在积极进行化学合成紫杉醇的研究工作,为使紫杉醇全合成走上工业化道路而不懈努力。2.2.3合成或半合成紫杉醇类似物 紫杉醇是手性分子，一个四元氧杂环(D环)与多种功能基与紫杉烷骨架相联接。构效关系研究表明，这些功能基对

27、紫杉醇的抗癌活性极为重要。紫杉醇的主要缺点为来源短缺和不溶于水。在临床应用中，溶解紫杉醇的赋形剂常会导致过敏反应及生物利用度降低，因此在寻求紫杉醇的资源开发中，希望能获得可溶于水并且抗癌活性与紫杉醇相当或更高的紫杉醇类似物。斯坦福大学化学系Wender以来源丰富而价廉的旅烯为原料合成了一些紫杉醇类似物，并已证实其中紫杉醇脱氧类似物对肿瘤有较高细胞毒作用。1988年，法国Potier等在半合成紫杉醇过程中以10-去乙酞巴可亭-为原料合成了紫杉萜 (taxotere，又名docetarel)。迄今为止尚未见活性比紫杉菇高的紫杉醇类似物，人们称紫杉萜为紫杉醇的第二代产品。紫杉萜亦是一种微管聚合促进剂

28、，其抗癌活性比紫杉醇稍高，并且易溶于水。作为细胞复制抑制剂对J774.2与P388细胞的抑制作用比紫杉醇高2.5倍，在对紫杉醇耐药的细胞中，紫杉萜的活性至少比紫杉醇高5倍。II期临床试验表明，紫杉萜对晚期复发性乳腺癌的有效率为54.7%，对非小细胞肺癌的有效率为25%，对耐铂卵巢癌的有效率为35%。2.3 运用生物技术生产紫杉醇2.3.1 利用红豆杉植物细胞、组织培养生产紫杉醇 1989年,美国农业部首先发现短叶红豆杉的植物细胞能产生紫杉醇。但并不是所有的短叶红豆杉的植物细胞都产生紫杉醇。从一些红豆杉的皮、茎和针叶所得到的细胞株并不产生紫杉醇,但它们能产生其他的紫杉烷类化合物,如C-14氧取代

29、化合物,这些化合物的含量可达细胞干重的2%。Navia Osorio等报道喜玛拉雅红豆杉的悬浮培养细胞在气升式反应器中细胞培养的紫杉醇含量可达2084 mgL-1/24 d,巴卡亭-含量达2567 mgL-1/28 d。在细胞的大规模培养前,应进行小规模培养,观察单位时间内单位质量的细胞中紫杉醇含量在最优的培养条件下是否能达到大规模生产的要求。红豆杉的小规模细胞培养研究首先就是要获取愈伤组织,从其中选出高紫杉醇含量细胞系，继代后进行悬浮培养，调整好一些影响因素之后进行代谢调控，以期获得最大紫杉醇含量和最大生长速率。2.3.2 利用器官培养法生产紫杉醇 利用红豆杉营养器官培养法生产紫杉醇,是解决

30、紫杉醇来源的一条重要途径和热点研究方向之一。目前,采用的方法主要有胚胎培养法、芽培养法和根培养法等。利用胚胎培养在短时间内可以获得一定数量的苗木,并可从中选择紫杉醇含量高的个体,欧洲红豆杉离体培养胚胎的萌发率已达100%；芽培养法主要利用红豆杉侧芽通过离体培养,获取大量的种苗,规模化、集约化营造原料林；根培养法主要利用根癌农杆菌侵染红豆杉的叶片获得了发状根,从中提取到了紫杉醇11。2.3.3 利用红豆杉发根培养生产紫杉醇 发根农杆菌Ri质粒转化植物诱导出的发根,具有生长速度快,生长不需要植物激素及次生代谢物含量高等特点,因此国内外许多实验室都开展了这方面研究工作。由于紫杉醇的市场潜力很大,致使

31、许多研究结果没有公开发表,而是首先申请专利。第一个利用红豆杉发根培养生产紫杉醇的专利是理查德(Richard)等于1993年提出的。他们用发根农杆菌转化太平洋红豆杉获得发根并检测到了紫杉醇；埃尔曼诺(Ermanno)等(1993)的专利则是用发根农杆菌ATCC15834转化东北红豆杉叶片,获得发根并提取到紫杉醇。但是这两个专利均没有透露发根生长状况和紫杉醇含量。据Plaut Carcasson Y等(1994)的专利介绍,用发根农杆菌ATCC39207和根癌农杆菌C58 (含质粒pGV3296)转化红豆杉幼苗诱导发根,0.06g发根在5周内鲜重增加到56.26g,但是没有报道紫杉醇含量。Ham

32、ada等(1995)利用发根农杆菌A4和15834等菌株转化红豆杉获得发根,发根中紫杉醇含量比愈伤组织中增加50倍。我国在红豆杉发根诱导方面也取得了突破性进展,并公开发表了试验结果。黄遵锡等(1997)报道用发根农杆菌A4感染短叶红豆杉芽外植体,3035天后诱导发根,诱导率达到30%,红豆杉发根在无激素的B5培养液中悬浮培养20天,生物量增加9倍,是同等条件下短叶红豆杉愈伤组织的2.9倍。经紫杉醇单克隆抗体酶联免疫反应检测,发根中含有紫杉醇,其含量为短叶红豆杉愈伤组织的1.38.0倍,而且悬浮培养过程中发根也向培养液中分泌0.010.03mg/L的紫杉醇。这也是世界上首次公开报道红豆杉发根诱导

33、和培养方面的研究结果。这些研究结果为利用红豆杉发根培养工业化生产紫杉醇打下了坚实的基础12。2.3.4利用内寄生真菌生产紫杉醇 美国蒙大拿州立大学从蒙大拿国家冰川公园的25棵短叶红豆杉中分离出一种内寄生真菌,经培养3周后可产生紫杉醇及相关化合物,这一真菌被命名为安德列菌Taxomyces andreanae,该真菌产生的紫杉醇在结构和生物活性方面与从树皮中提取得到的紫杉醇相同13。美国的Strobel等从西藏红豆杉树皮中分离出内寄生真菌,其菌丝在培养基中可产生紫杉醇,该真菌经鉴定为小孢盘多毛孢Peltalotiopsis microspora,该真菌于23静止培养23周后,紫杉醇产量可达607

34、0g/L,生产的紫杉醇经质谱分析与紫杉醇标准品完全一致,经26种癌细胞系检测其抗癌活性,表明与紫杉醇相同。用红豆杉植物内寄生真菌生产紫杉醇与紫杉烷已受到各国学者普遍关注,BMS,ESCA gendic,Lederle实验室及我国都在进行研究,本法的优点在于:易于大规模培养；能在简单的培养基上生长；比栽培生长速率高,可获得大量产物等。但关键问题一是改造和优化发酵条件；二是改造菌种；三是寻找一个特殊的真菌调节剂。从实用的角度来说,利用微生物生产生物活性物质有下列优点:(1)生产的可重复性,在工业上可用发酵罐大规模进行生产；(2)微生物的发酵生产不需要特别的技术；(3)增加微生物的生产能力比较容易,

35、而利用植物组织细胞的培一点；(4)可以通过培养条件的改变来生产不同的生物活性物质。1993年,Gary Strobel等人14，15发现,寄生于某一种红豆杉上的真菌管其产率很低,仅2450ng/L,但是由于真菌的基因操作要比植物容易得过传统的方法和基因工程的方法来增加紫杉醇在真菌中的产量。如果可以真菌生产紫杉醇的成本将比用植物细胞生产紫杉醇小得多。2.3.5 利用代谢工程生产紫杉醇 通过代谢工程,在微生物中组合表达紫杉醇生物合成相关基因,利用“微生物工厂”生产紫杉醇前体baccatin,再半合成紫杉醇是一种具有广阔前景、较为可行的途径。迄今为止,已经在大肠杆菌和酵母中进行了紫杉醇组合表达的研究

36、,取得了一系列令人鼓舞的成绩。2001年Huang等将IPP异构酶、GGPP合酶以及紫杉烯合酶3个基因导入E.coli,获得了13mg/L培养物的紫杉烯,这是世界上第一例通过非紫杉烷类产生菌获得紫杉烷类化合物的报道,说明在微生物中可通过组合不同的紫杉醇生物合成相关基因来获得不同的目的产物。2005年该实验室通过构建紫杉烯组合表达系统,从大肠杆菌中检测到了紫杉醇前体紫杉烯。但由于大肠杆菌不含有型P450氧化酶,因此,它不能有效地对代谢中间产物进行氧化,也就不能获得计划的目的产物。于是,紫杉醇酵母组合表达系统成为紫杉醇组合表达的另一个选择,该实验室构建了紫杉烯的酵母组合表达系统,同时构建了包含紫杉

37、烯合酶基因的表达载体,将这两个表达载体共转化酵母细胞,GC-MS检测到了紫杉烯的存在。紫杉醇组合表达系统虽然还处在起步阶段,但上述成绩使人们看到了利用生物技术生产紫杉醇前体的广阔前景。2.3.6 紫杉醇的生物合成 美国Croteau R教授的实验室在紫杉醇生物合成的研究中作了大量的、卓有成效的工作,经过十几年的努力,紫杉醇大部分生物合成途径已经明确。现已知从二萜共同前体=牛儿基=牛儿基焦磷酸(geranylgeranyl pyrophosphate,GGPP)到紫杉醇需要约19个酶促步骤。GGPP是由异戊烯焦磷酸( isopentenyl pyrophosphate, IPP)和甲基丙烯基焦磷

38、酸(dimethylallyl pyrophosphate,DMAPP)在GGPP合酶的作用下生成的；然后,GGPP在紫杉烯合酶的作用下生成紫杉烯,形成6/8/6环紫杉烷类化合物的A,B,C环。紧接着,通过连续的氧化反应,首先是C5和C10,然后是C13,C2和C9,接着是C7,最后是C1位的羟化,再经D环形成和依赖Co-A酰基化反应,形成10-DAB,进而形成紫杉醇(图3) 16 。催化这些反应的酶基因大部分已经被克隆,而且其编码的蛋白也得到了功能鉴定,但紫杉醇特有的环氧丙烷环(D环),C9酮基及C1羟基的形成机制和有关酶类还有待进一步研究。图2.1 紫杉醇的生物合成途径紫杉醇生物合成全过程

39、约20步酶促反应。其中紫杉二烯合酶、紫杉二烯-5-羟化酶、紫杉烷-10-羟化酶、紫杉烷-13-羟化酶、紫杉二烯-5-乙酰转移酶、紫杉烷-2-苯甲酰转移酶、10-去乙酰巴卡亭-10-乙酰转移酶、3-氨基-3-苯基丙酰转移酶和3-N-去苯甲酰-2-脱氧紫杉醇苯甲酰转移酶等主要的相关酶基因已成功克隆与表达,为进一步利用现代生物技术提高紫杉醇产量奠定了良好基础。然而,紫杉醇生物合成的详细过程、反应机理还没完全阐明,近一半的相关酶基因还没有得到克隆与表达,其中,参与形成紫杉醇环氧D环的环氧化酶和C5的乙酰基转移到C4的变位酶还未确定；催化紫杉醇核心骨架及侧链C2羟基化反应的细胞色素P450羟化酶中有5个

40、酶还未成功表达；参与侧链生物合成的苯丙氨酸变位酶也未克隆与表达。2.3.7 运用基因工程生产紫杉醇 利用基因工程技术提高紫杉醇含量取决于两个条件:红豆杉遗传转化和植株再生体系的建立及红豆杉中与紫杉醇生物合成相关基因的克隆。目前这两方面的研究工作都取得了突破性进展,在红豆杉属植物细胞生物合成紫杉醇途径的研究方面,Rodney Croteau等确定了紫杉醇三环二萜骨架合成的第一步反应是由紫杉二烯合成酶(taxadiene synthase)催化合成taxa-4(5),11(12)-diene,进而又成功地克隆了该合成酶的cDNA序列,并且初步确定了紫杉醇骨架合成的第二步反应为细胞色素P450催化羟

41、基化反应生成taxa-4(20),11(12)-5-ol。另外,紫杉醇C13侧链的生物合成途径也基本明确。这些最新的生物合成途径研究结果为紫杉醇生物合成基因调控奠定了可靠基础。在红豆杉转化体系建立方面,卢安(Luan)等利用短叶红豆杉合子胚与含有GUS基因的pBI121质粒DNA共培养,成功地使GUS基因在胚细胞中得到瞬时表达。汉(Han KH)等用根癌农杆菌转化红豆杉幼茎,获得了转化的愈伤组织。Plaut Carcsson(1994)用发根农杆菌转化红豆杉获得发根后,先在含有1mg/L NAA,0.1mg/L BA培养基上培养,然后再转至含5mg/L BA培养基上培养8周,获得了转基因植株。

42、这些工作为向红豆杉中导入目的基因提供了有效的系统,今后的工作应着眼于利用已有的材料和实验体系,获得转基因细胞和植株,对转基因植株的紫杉醇合成能力进行评价。这些研究不仅为紫杉醇生产开辟了新途经,而且为今后将目的基因导入红豆杉细胞奠定良好的基础。2.4 紫杉醇的提取与分离纯化技术无论从天然红豆杉植物中还是从培养的植物细胞及微生物发酵液中提取紫杉醇，或者研究各种紫杉烷类化合物的抗癌活性都涉及到如何提取和分离的问题。开发出高效、快捷、经济实用的提取和分离手段，将直接影响到紫杉醇的产量。紫杉醇在不同植物来源以及植物体不同部位的含量与提取分离有着直接关系。在提取之前，要进行初步的预处理，然后进行下一步的萃

43、取。余广鳌等寻找了浸取紫杉醇的最佳溶剂。对不同溶剂浸取红豆杉细胞中的紫杉醇进行了研究，结果发现：在乙酸乙酯、丙酮、甲醇、乙醇、乙醚、二氯甲烷、氯仿等7种溶剂中，单一溶剂的浸取效果以甲醇最好，而乙醚、氯仿、二氯甲烷浸取效果较差。目前的萃取方法主要有：液-液萃取法、固相萃取法、CO2超临界流体萃取法等。分离纯化技术，包括柱层析法、薄层色谱法、沉淀法、胶束动电毛细管色普法、膜分离法、树脂吸附分离法、高速逆流色谱法、化学反应法和药理作用靶点法等17。2.5紫杉醇生产的研究现状总结及存在的问题 2.5.1 研究现状总结 虽然关于紫杉醇的研究取得了很大的进展，已发表了500多篇文献，但仍没有比较成型的可进

44、行工业化生产的技术。主要原因是：从植物中提取紫杉醇是目前临床用药的一种来源，紫杉醇主要从红豆杉植物的树皮中提取,但由于紫杉醇在红豆杉中含量极低,只有树皮干重的00001% 0008%,加之紫杉醇溶解性差,使紫杉醇的可利用率更低。而且红豆杉属植物全世界仅有11种,生长缓慢、种群密度小、自身繁殖度低。供应300 kg紫杉醇需砍伐4080万株5060年生的红豆杉。以目前的提取分离方法,这样大的供应量已经威胁到红豆杉属植物的长期存留和地区分布,有资料显示,自20世纪90年代初开始的10年间,云南的红豆杉资源几乎消耗了80%。紫杉醇的发现,使已濒临消失的红豆杉更加危在旦夕。因此运用其他方法生产紫杉醇就显

45、得尤为重要。由于树叶中10-去乙酰巴卡亭-及巴卡亭-含量较高,因此从植物中提取紫杉醇前体半合成成为目前临床用药的主要渠道,但通过10-去乙酰巴卡亭-或巴卡亭-半合成紫杉醇,也需要消耗大量的植物,因此,也面临着生态和资源的问题。化学全合成的方法由于路线复杂,合成步骤多,至今尚未应用于工业生产。通过细胞培养来生产紫杉醇,面临着诸如细胞株不稳定、放大培养困难、目的产物含量低和在线检测容易导致污染等技术问题,目前还没见工业化的报道。通过内生真菌来生产紫杉醇,由于紫杉醇含量和产量很低,并且目前对于内生真菌的相关遗传学和分子生物学的研究尚处于起步阶段,短期内可能不会有太大的突破。利用生物合成途径生产紫杉醇

46、,随着越来越多相关基因的克隆和功能重组表达,从基因水平上进行改造亦将成为解决紫杉醇资源短缺的有效途径。2.5.2 存在的问题 在开发利用紫杉醇的过程中，主要存在以下几个问题18：盲目建厂。由于紫杉醇的经济效益高，部分地区和单位既无生产技术，又缺乏有机化工生产经验，盲目投资建厂而造成巨大经济扭失，资源浪费严重。研究滞后。全世界约有红豆杉属植物n种，北半球分布较广泛，但不同产地、种类、采收季节和加工方法影响其提取率，其影响因素尚待研究。改进提取方法。在提取紫杉醉的过程中，虽然有机溶剂萃取，但所选的有机溶剂和生产工艺不同，其提取率差异较大.红豆杉植物体中现已分离出170多种化学成分，其中属于紫杉烷类

47、二裕约有60种。目前国内采用的提取工艺一般得到紫杉醇和10-去乙酰基浆果赤霉素，资源浪费严重，因此，应加强对提取方法的研究，综合利用资源。改良剂型。紫杉醇水溶性差，目前批准上市的制剂均用聚经乙基蓖麻油作溶媒，毒副作用大，注射困难。因此，应加强开发水溶性好的紫杉醇类抗癌药，改良剂型，研究最佳治疗方案。加强资源植物红豆杉的研究。紫杉醇全合成虽已获得成功，但技术路线复杂，尚未达到商品化开发，目前仅从植物体中分离提取。为了保护资源，必须加强对红豆杉资源植物的研究，加速人工培植工作。结 论紫杉醇研究发展热点的背后是潜在的巨大市场推力和日益枯竭的原料供应。据世界卫生组织(WTO)统计资料表明,全世界癌症每

48、年发病约1 000万人,死亡约700万人,已成为仅次于心血管病的人类第二杀手。紫杉醇是当今世界上公认为广谱、活性最强的抗癌药物,尤其对子宫癌、卵巢癌、乳腺癌具有特殊的疗效,它的问世被誉为90年代国际上抗癌药最伟大成就之一,而紫杉醇的药源植物资源极为有限,再生能力弱,紫杉醇含量低,因此,其供应危机即相伴而生,紫杉醇药源的短缺成为制约紫杉醇工业化生产和推广应用的突出问题。紫杉醇已当之无愧地成为了国内医药市场上的头号抗肿瘤药物。紫杉醇产品在国内、国外市场上的旺销会进一步促进国内人工红豆杉林业的发展与紫杉醇原料药产量的增加,从而形成一种良性循环局面19。综上所述,紫杉醇的药源保护及开发技术已日臻成熟,对进一步合理开发红豆杉属植物资源,促进高品质紫杉醇的工业化生产具有生态、社会及经济多重意义。参考文献1 李先良等.紫杉醇生产方法的