小鼠骨髓来源树突状细胞（BMDC）的培养.pdf

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1、 美国美国 PeproTech(派普泰克派普泰克)中国代表处中国代表处 江苏省苏州市玉山路 99 号钻石广场 2 幢 416 室邮编：215021 电话：0512 6832 5983，6832 5993在线咨询：8000 53055(企业 QQ)邮箱：网址： 0小鼠骨髓来源树突状细胞小鼠骨髓来源树突状细胞(BMDC)的培养的培养 主要目次主要目次【经典的 BMDC 制备方法简图】-1【BMDC 培养的发展简史】-2【经典的 BMDC 培养法】-Inaba 法(改良)-4【BMDC大量制备法】-Son法-6【BMDC 大量制备法】-Lutz 法-7【注意事项】-9 摘自文献 Inaba K,et

2、 al.J Exp.Med.1992;176(6):1693-702 3 美国美国 PeproTech(派普泰克派普泰克)中国代表处中国代表处 江苏省苏州市玉山路 99 号钻石广场 2 幢 416 室邮编：215021 电话：0512 6832 5983，6832 5993在线咨询：8000 53055(企业 QQ)邮箱：网址： 1【经典的【经典的 BMDC 制备方法简图】制备方法简图】【前 言】【前 言】C 是“Dendritic Cells”的缩写，中文全称为“树突状细胞”，因其成熟时伸出许多树突样或伪足样突起而得名。DC 是由 2011 年诺贝尔奖获得者、加拿大籍科学家 Ralph M.

3、Steinman 于 1973 年发现的1，是目前发现的功能最强的抗原递呈细胞(Antigen Presenting Cells,APC)。已证实，DC 是唯一能够显著刺激初始 T 细胞(Nave T cells)增殖的 APC，而其它种类的 APC(如单核巨噬细胞，B 细胞等)仅能刺激已活化的或记忆性的 T 细胞，因此 DC 是机体适应性 T 细胞免疫应答的始动者，在肿瘤免疫中也发挥着极其重要的作用。虽然 DC 存在于体内多种组织中，但含量很少，无法满足科学研究和临床治疗的需要，所以人们尝试多种方法来体外培养和扩增 DC。对于人，最常用的方法是从人外周血单个核细胞(PBMC)诱导 DC 的产

4、生。而对于小鼠，最常见的方法是从骨髓细胞诱导产生 DC，即骨髓来源的 DC(Bone Marrow-Derived Dendritic Cells，BMDC)。鉴于功能分析和分子生物学研究的需要，获得更高数量和更高纯度的 BMDC 是大家一直追求的目标，本文将与大家分享 BMDC 的经典制备方法和大量制备法，大家可根据自身 D诱导分化诱导分化0d2d6d8d10dBoneMarrowImmatureDC1.小鼠断颈处死，取股骨和胫骨；小鼠断颈处死，取股骨和胫骨；2.分离骨髓并溶血；分离骨髓并溶血；3.加入加入rmGMCSF(25ng/ml)和和rmIL4(10ng)培养。培养。第第 2d 和第

5、和第 4d3/4 量换液，并补加足量量换液，并补加足量 GMCSF 和和 IL4收集收集DC，重新铺板，重新铺板，以促进以促进DC更成熟更成熟加入以下任意一种成熟诱导剂：加入以下任意一种成熟诱导剂：1.rmTNF (2550ng/ml)2.LPS(1 g/ml)3.rmCD40L(1 g/ml)获得成熟的获得成熟的 BMDC4d再铺板再铺板完全成熟完全成熟MatureDC 美国美国 PeproTech(派普泰克派普泰克)中国代表处中国代表处 江苏省苏州市玉山路 99 号钻石广场 2 幢 416 室邮编：215021 电话：0512 6832 5983，6832 5993在线咨询：8000 53

6、055(企业 QQ)邮箱：网址： 2需要选择使用。另外，我们还备有实用的我们还备有实用的 BMDC 培养操作视频培养操作视频(内部交流，非商用内部交流，非商用)，因文件比较大，若需要，可通过我们的企业，因文件比较大，若需要，可通过我们的企业 QQ(号码为：号码为：800053055)向我们索取发送向我们索取发送。【BMDC 培养的发展简史】培养的发展简史】1973 年-加拿大籍科学家 Raplph M.Steinman 在美国洛克菲勒大学(Rockefeller University)工作时从小鼠外周淋巴器官(脾、淋巴结和派氏集合淋巴结)中首次鉴定出树突状细胞(Dendritic Cells,

7、DC)1。Steinman 也因此获得了 2011 年诺贝尔生理学或医学奖。1992 年-日本京都大学(Kyoto University)的 Inaba 在添加 GM-CSF(粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子)的情况下，分别成功从小鼠血液和骨髓细胞体外诱导出大量的 DC2,3。因此，Inaba 被认为是小鼠被认为是小鼠 DC 体外培养的创立者，且体外培养的创立者，且 Inaba 法被称为小鼠法被称为小鼠 BMDC 培养的经典方法。培养的经典方法。1994 年-奥地利因斯布鲁克大学(University of Innsbruck)的 Romani 等发现 GM-CSF 和IL-4(白细胞介素 4)联

8、合诱导，可从人血液 PBMC(外周血单个核细胞)制备出大量的 DC，而GM-CSF 单独诱导的效果不好4。后来，科学家也将 IL-4 应用于小鼠 BMDC 的培养5,6。1999 年-德国明斯特大学(University of Munster)的 Labeur 研究表明，单独用 GM-CSF诱导的 BMDC 为未成熟 DC(immature DC,iDC)，GM-CSF 和 IL-4 联合诱导出来的 BMDC的成熟度居中，添加 CD40L 或 LPS 可进一步诱导 DC 完全成熟，即成熟 DC(mature DC,mDC)7。1999 年-德国埃尔朗根大学(University of Erla

9、ngen)的 Lutz 开发出一种可获得超大量BMDC 的方法，每只小鼠可获得的每只小鼠可获得的 BMDC 的数量是的数量是 Inaba 经典方法的经典方法的 50 倍之多倍之多，达达 1-3 x 108个个 DC 细胞细胞/小鼠小鼠8。该法被。该法被 DC 研究者广泛认可和使用研究者广泛认可和使用。1.这些工作均是在RalphM.Steinman的参与下完成的；2.Inaba培养的BMDC来源于小鼠股骨和胫骨中的骨髓；3.Inaba先用抗体+补体法去除骨髓中的淋巴细胞，以防淋巴细胞对BMDC培养的影响；4.在诱导分化过程中，为防止粒细胞的干扰，Inaba通过每2天轻摇培养板并3/4体积换液的

10、方法来尽量去除粒细胞；5.Inaba证实单用GMCSF通过68天的培养，即可从骨髓细胞诱导得到大量的DC细胞，而且混合淋巴细胞反应提示其为成熟的DC细胞；6.该法可从一个小鼠的骨髓中培养获得 57x106个DC细胞。美国美国 PeproTech(派普泰克派普泰克)中国代表处中国代表处 江苏省苏州市玉山路 99 号钻石广场 2 幢 416 室邮编：215021 电话：0512 6832 5983，6832 5993在线咨询：8000 53055(企业 QQ)邮箱：网址： 3 2002 年-美国匹兹堡癌症研究院大学(University of Pittsburgh Cancer Institute

11、(UPCI)的 Son 也研发出一种超大量 BMDC 培养方法，称为 bulk-culture method。该法每只小鼠可获得的该法每只小鼠可获得的 BMDC 的数量是的数量是 Inaba 经典方法的经典方法的 7-10 倍，即倍，即 3 4 x 107个个 BMDC，而且培养时间与，而且培养时间与 Inaba 经典方法相似，仅需经典方法相似，仅需 7 天天9。摘自文献 Son YI,et al.J Immunol Metods.2002;262(1-2):145-57 9 1.骨髓不作任何预先处理；2.使用细菌培养皿(PetriDish)替代细胞培养板；3.细胞的初始铺板密度低，为2x10

12、5/ml；4.培养时间延长至1012天；5.仍仅用GMCSF诱导，但第8天或第10天后减量使用；6.第6天和第8天半量换液，但吸出的悬浮细胞离心后放回原板。1.骨髓取出后仅溶血，不做任何其它处理；2.使用6孔培养板培养；3.培养过程中使用GMCSF+IL4联合诱导；4.培养的第4天和第7天补加足量的GMCSF和IL4。美国美国 PeproTech(派普泰克派普泰克)中国代表处中国代表处 江苏省苏州市玉山路 99 号钻石广场 2 幢 416 室邮编：215021 电话：0512 6832 5983，6832 5993在线咨询：8000 53055(企业 QQ)邮箱：网址： 4【经典的【经典的 B

13、MDC 培养法】培养法】-Inaba 法法(改良改良)3,10?背景：背景：1.Inaba 法获得的 BMDC 数目为 5-7 x 106个/小鼠；2.Inaba 原法操作比较复杂，需要将骨髓中的淋巴细胞等用抗体+补体法预先去除，后来的改良法均省却了这个步骤，其实 Inaba 后来自己也说这个步骤虽然可提高BMDC 的纯度，但不会对 BMDC 的生成产生影响，可做可不做10；3.Inaba 原法仅用 GM-CSF 来诱导 BMDC 的产生，虽然得到的 BMDC 在混合淋巴细胞反应中有较强的刺激能力，但 DC 的成熟度不及 GM+IL-4 的联合诱导，所以后来的改良法中多用 GM+IL-4 联合

14、诱导。?培养步骤：培养步骤：1.小鼠骨髓细胞的获得小鼠骨髓细胞的获得 1.1 小鼠(6-10 周龄)颈椎脱臼法处死，手术取出所有股骨(femurs)和胫骨(tibias)，并剪刀和镊子将骨周围的肌肉组织尽量去除干净；注：不要损伤到骨。注：不要损伤到骨。1.2 将骨移至超净台内，并用盛有 70%酒精的无菌培养皿浸泡 2-5min，以消毒灭菌，然后用无菌的 PBS 洗 2 次；1.3 将骨移入另一个盛有 PBS 的新培养皿中，用剪刀剪去骨两端，再用注射器抽取 PBS，针头分别从骨两端插入骨髓腔，反复冲洗出骨髓至培养皿中，直至骨完全变白；1.4 收集骨髓悬液，用 200 目尼龙网滤去小碎片和肌肉组织

15、；1.5 滤过液 1200 rpm 离心 5min，弃上清；1.6 加入 2 ml 氯化铵红细胞裂解液(1x)，重悬细胞，室温孵育 3-5min，最长 10min；注：因氯化铵红细胞裂解液对骨髓细胞有一定的伤害作用，所以要尽量缩短溶血时间。注：因氯化铵红细胞裂解液对骨髓细胞有一定的伤害作用，所以要尽量缩短溶血时间。1.7 加入 10 ml PBS 中和裂解液的作用，然后 1200 rpm 离心 5min，弃上清;1.8 PBS 洗 1 次，然后用含 10%FBS 的 RPMI 1640 培养液重悬细胞，至此已获得小鼠骨髓细胞。2.BMDC 的诱导分化的诱导分化 2.1 步骤 1 中获得的小鼠骨

16、髓细胞计数后用含 10%FBS 的 RPMI 1640 完全培养液调整细胞浓度为 0.5-1 x 106/ml；氯化铵红细胞裂解液的配制：氯化铵红细胞裂解液的配制：1.先配制10 x的贮存液，配法如下：称取82.9gNH4Cl，10.0gKHCO3和0.37gNa2EDTA，溶于1L的蒸馏水中，0.22m滤膜过滤除菌，4oC储存6个月；注：可根据需要配制适量的注：可根据需要配制适量的10 x贮存液，其中各组分需成比例增减。贮存液，其中各组分需成比例增减。2.临用前，将10 x贮存液用无菌蒸馏水1:9稀释成1x工作液即可。美国美国 PeproTech(派普泰克派普泰克)中国代表处中国代表处 江苏

17、省苏州市玉山路 99 号钻石广场 2 幢 416 室邮编：215021 电话：0512 6832 5983，6832 5993在线咨询：8000 53055(企业 QQ)邮箱：网址： 52.2 铺至 24 孔培养板内，每孔 1ml 细胞，同时加入重组小鼠 GM-CSF(20ng/ml)和 IL-4(10ng/ml)，37，5%CO2培养箱培养，此为培养的第 0 天；注：注：1)一般一只小鼠大约可收获一般一只小鼠大约可收获4-5 x 107个骨髓细胞，所以可以铺至少个骨髓细胞，所以可以铺至少40-50个个24孔板板孔。孔板板孔。2)GM-CSF和和IL-4的使用浓度区间分别为的使用浓度区间分别为

18、20-50ng/ml和和10-40ng/ml。2.3 每 2 天轻轻摇晃培养板，然后 3/4 体积更换新鲜培养液，并补足细胞因子。注：注：1)此步骤的目的是去除粒细胞和淋巴细胞，因粒细胞和淋巴细胞为悬浮生长；此步骤的目的是去除粒细胞和淋巴细胞，因粒细胞和淋巴细胞为悬浮生长；2)Inaba认为培养的前认为培养的前4天，大部分天，大部分DC贴壁仍较牢，所以此法不会大量损失贴壁仍较牢，所以此法不会大量损失DC；3)若发现损失的若发现损失的DC细胞过多，可仅在培养的第细胞过多，可仅在培养的第2天用此法换液；天用此法换液；4)在培养的第在培养的第4天，可以看到聚团生长的天，可以看到聚团生长的DC贴附于板

19、底，第贴附于板底，第6天则可观察到很多天则可观察到很多DC成集落生长。成集落生长。2.4 在第 5 天和第 8 天之间，轻柔吹打培养液，收集悬浮细胞及巯松贴壁生长的细胞；注：注：1)最佳收集时间是培养的第最佳收集时间是培养的第6天；天；2)此时的细胞已经是此时的细胞已经是BMDC，但成熟度不高，所以需要后续的再铺板（，但成熟度不高，所以需要后续的再铺板（subculture）步骤使其更成熟；）步骤使其更成熟；3)吸出培养液吸出培养液(含含DC细胞细胞)的的24孔培养板需补充新鲜的含重组小鼠孔培养板需补充新鲜的含重组小鼠GM-CSF(20 ng/ml)和和IL-4(10ng/ml)的的RPMI完

20、全培养液，完全培养液，继续培养，以便后面能够再次收集继续培养，以便后面能够再次收集BMDC。2.5 1200 rpm 离心 5min，弃上清；2.6 用含 10%FBS 的 RPMI 1640 完全培养液重悬细胞并计数，然后调整细胞浓度至 1 x 106/ml，并加入重组小鼠 GM-CSF(20 ng/ml)和 IL-4(10ng/ml)；2.7 细胞铺板至 100 mm 培养皿(每皿最多 10ml)或 6 孔培养板(2m/孔)。2.8 37，5%CO2培养箱继续培养 1-2 天；2.9 收集悬浮细胞，即为较成熟的 BMDC。注：注：1)第第2.5-2.8步为再铺板步为再铺板(subcultu

21、re)步骤，目的是使第步骤，目的是使第2.4步获得的步获得的BMDC更加成熟。更加成熟。2)再铺板后的再铺板后的3h内可见许多棘状贴壁细胞从内可见许多棘状贴壁细胞从DC簇中迁移出来，而培养簇中迁移出来，而培养1天后会发现这些贴壁细胞从培养板底脱离，而且可以看见在培养液中漂浮着许多典型的天后会发现这些贴壁细胞从培养板底脱离，而且可以看见在培养液中漂浮着许多典型的DC。3.BMDC 的完全成熟的完全成熟 注：步骤注：步骤2中获得的中获得的BMDC并非完全成熟的并非完全成熟的DC，若想得到完成成熟的，若想得到完成成熟的DC，还需，还需LPS，CD40L或或TNF-a等的诱导。等的诱导。3.1 步骤

22、2.4 或 2.9 中获得的 BMDC 以 1200rpm 离心 5min，弃上清；3.2 用含重组小鼠GM-CSF(20 ng/ml)和 IL-4(10ng/ml)的 RPMI完全培养液重悬沉淀，计数后调整细胞浓度为 1 x 106/ml；3.3 加入 24 孔培养板中，并加入成熟诱导剂，如 TNF-(250U/ml)，LPS(1g/ml)、或 CD40L(1g/ml)等；3.4 37，5%CO2培养箱培养 2 天；3.5 收集悬浮细胞及疏松贴壁生长的细胞即为成熟树突状细胞。美国美国 PeproTech(派普泰克派普泰克)中国代表处中国代表处 江苏省苏州市玉山路 99 号钻石广场 2 幢 4

23、16 室邮编：215021 电话：0512 6832 5983，6832 5993在线咨询：8000 53055(企业 QQ)邮箱：网址： 6【BMDC 大量制备法】大量制备法】-Son 法法9?背景：背景：1.该法可在 7 天内获得 30-40 x 106个 DC/小鼠，是 Inaba 经典方法的 7-10 倍。DC经 14.5%甲泛葡胺(Metrizamide)梯度离心后，纯度(即 CD11c+/I-Ab+细胞)可达85-95%。2.该法获得的 DC 的内吞能力弱于 Inaba 经典方法，但分泌的 IL-12p70 量相似；3.该法获得的 DC 在混合淋巴细胞反应中比 Inaba 经典方法

24、呈现更强的刺激能力；4.该法获得的 DC 能引起更强的特异性 T 细胞反应；5.以上结果提示，该法比经典方法能获得更多、更成熟的 BMDC。?培养步骤：培养步骤：1.小鼠骨髓细胞的获得小鼠骨髓细胞的获得 见 Inaba 法(改良)中的相应步骤。2.BMDC 的大量制备的大量制备 2.1 步骤 1 中获得的小鼠骨髓细胞计数后用含 10%FBS 的 RPMI 1640 完全培养液调整细胞浓度为 2 x 105/ml；2.2 铺至 6 孔培养板内，每孔 5ml 细胞，同时加入重组小鼠 GM-CSF(1000U/ml)和 IL-4(1000U/ml)，37，5%CO2培养箱培养；注：注：1)作者试探了

25、作者试探了125U/ml、250U/ml、500U/ml和和1000U/ml四个细胞因子浓度，发现浓度越低，四个细胞因子浓度，发现浓度越低，BMDC细胞产量和成熟度越低，所以仍建议用细胞产量和成熟度越低，所以仍建议用1000U/ml。2)笔者认为，笔者认为，1000U/ml是一个非常高的浓度，会导致培养成本过高。是一个非常高的浓度，会导致培养成本过高。2.3 在培养的第 4 天，向培养体系中补充重组小鼠 GM-CSF(1000U/ml)和 IL-4(1000U/ml)；注：向培养体系中直接补充细胞因子而不换液的目的是避免出现任何细胞损失，以获得最大量的注：向培养体系中直接补充细胞因子而不换液的

26、目的是避免出现任何细胞损失，以获得最大量的DC。笔者认为，培养过程中必然会出现培养液发黄的情况，如果不换液而只是添加细胞因子，细胞很快会因为营养不够而死亡。所以笔者建议在第。笔者认为，培养过程中必然会出现培养液发黄的情况，如果不换液而只是添加细胞因子，细胞很快会因为营养不够而死亡。所以笔者建议在第4天和第天和第7天时将培养液半量或天时将培养液半量或3/4量吸出，离心后加入含足量量吸出，离心后加入含足量GM-CSF和和IL-4的新鲜培养液重悬细胞沉淀，然后再将细胞放回至原板。的新鲜培养液重悬细胞沉淀，然后再将细胞放回至原板。2.4 培养的第 7 天收集 DC，用 2-4ml RPMI 1640

27、完全培养液重悬，加至等体积的14.5%(w/v)甲泛葡胺上，1200 x g 室温离心 20min；注：此时的注：此时的DC为不完全成熟的为不完全成熟的BMDC，要想进一步成熟，请跳至步骤，要想进一步成熟，请跳至步骤3。2.5 收集中间层，并用 RPMI 1640 完全培养液洗 3 次备用。3.BMDC 的完全成熟的完全成熟 3.1 步骤 2.4 中收集的 BMDC，重新铺板，并向培养体系中加入重组小鼠 GM-CSF(1000U/ml)和 IL-4(1000U/ml)，以及 LPS(1-10g/ml)3.2 37，5%CO2培养箱培养 2 天，获得成熟的 BMDC。美国美国 PeproTech

28、(派普泰克派普泰克)中国代表处中国代表处 江苏省苏州市玉山路 99 号钻石广场 2 幢 416 室邮编：215021 电话：0512 6832 5983，6832 5993在线咨询：8000 53055(企业 QQ)邮箱：网址： 7【BMDC 大量制备法】大量制备法】-Lutz 法法8?背景：背景：1.Lutz 法与 Son 法相似，均可大量制备 BMDC，但与 Son 法相比，Lutz 法更为广泛地被采用法更为广泛地被采用，从以下两个方面可以得到印证：1)虽然 Lutz 法比 Son 法早发表 3 年(分别是 1999 年和 2002 年)，但截至 2015 年12 月，PubMed 中已有

29、 633 篇文献中引用 Lutz 法，而仅有 24 篇文献引用 Son法。2)在美国著名的学术社交平台： 上有一个交流帖，问：Does anyone have a protocol for generating dendritic cells from mouse bone marrow using GM-CSF?回答者中大多数推荐和盛赞 Lutz 的 BMDC 培养法。2.该法可获得更多的 BMDC，达 1-3 x 108个/小鼠，而且纯度可达 90-95%；3.该法比 Son 法使用的细胞因子浓度低得多，仅为 200U/ml，而且培养的第 8 天到第 10 天降为 30-100U/ml，这

30、样可以大幅节约试剂成本；4.该法与该法与 Inaba 经典方法和经典方法和 Son 法的最大不同是使用细菌培养皿法的最大不同是使用细菌培养皿(Petri dish)而非细胞培养板来培养骨髓细胞。而非细胞培养板来培养骨髓细胞。Inaba 的解释是细菌培养皿不容易使骨髓中的巨噬细胞贴壁，从而抑制巨噬细胞的发育，进而避免巨噬细胞对 DC 成熟的抑制作用，这可能是该法能够以较低铺板密度获得大量 BMDC 的主要原因。5.但该法的培养时间较长，需要 10-12 天，一方面是为了获得更多的 BMDC，另一方面，大多数粒细胞和淋巴细胞很难存活这么长时间，因此可提高最终获得的BMDC 的纯度；6.该法仅用 G

31、M-CSF 进行诱导培养，得到的 BMDC 中未成熟和成熟 DC 均有，若要进一步提高成熟度，需用 LPS 或 TNF-再诱导 1-2 天，其中成熟 DC 细胞的含量将达到 50-70%。?培养步骤：培养步骤：1.小鼠骨髓细胞的获得小鼠骨髓细胞的获得 见 Inaba 法(改良)中的相应步骤，注意省去溶血步骤。2.BMDC 的大量制备的大量制备 2.1 步骤 1 中获得的小鼠骨髓细胞计数后用含 10%FBS 的 RPMI 1640 完全培养液调整细胞浓度为 2 x 105/ml；2.2 铺至 100mm 细菌培养皿(Petri Dish)中，每皿 10ml 细胞，同时加入重组小鼠GM-CSF(2

32、00U/ml，对于 PeproTech 的 GM-CSF，相当于 20ng/ml)，37，5%CO2培养箱培养；注：此处使用的是细菌培养皿，而非细胞培养板。注：此处使用的是细菌培养皿，而非细胞培养板。2.3 第 3 天时，向培养皿中再加入 10ml 含 20ng/ml 重组小鼠 GM-CSF 的完全培养液；2.4 第 6 天和第 8 天分别半量换液，即收集旧培养液，离心后用含 20ng/ml 重组小鼠 GM-CSF 的完全培养液重悬细胞沉淀，然后再将细胞悬液放回原皿；2.5 第 10 天时可收集细胞，即为 BMDC。美国美国 PeproTech(派普泰克派普泰克)中国代表处中国代表处 江苏省苏

33、州市玉山路 99 号钻石广场 2 幢 416 室邮编：215021 电话：0512 6832 5983，6832 5993在线咨询：8000 53055(企业 QQ)邮箱：网址： 8注：注：1)此时也可继续培养至第此时也可继续培养至第12天。若继续培养，可使用天。若继续培养，可使用30-100U/ml(即即3ng-10ng/ml)的重组小鼠的重组小鼠GM-CSF。2)虽然培养时间越长，细胞表型上越成熟虽然培养时间越长，细胞表型上越成熟(CD11c的表达量高的表达量高)，但混合淋巴细胞反应实验显示，培养第，但混合淋巴细胞反应实验显示，培养第8天和第天和第10天收获的天收获的BMDC具有最强的刺激

34、能力，而培养第具有最强的刺激能力，而培养第12天的天的BMDC刺激能力明显减弱。刺激能力明显减弱。3)经过经过10天的培养，每皿平均可收获天的培养，每皿平均可收获9.2 x 106个细胞。个细胞。3.BMDC 的完全成熟的完全成熟 3.1 培养第 10 天的 DC 用移液器轻轻吹打收集悬浮细胞，300 x g 室温离心 5min；3.2 弃上清，用 10ml RPMI 1640 完全培养液重悬细胞沉淀，然后铺于 100 mm 细胞培养板；注：此处不再用细菌培养皿，而是用细胞培养板，因注：此处不再用细菌培养皿，而是用细胞培养板，因BMDC已形成，呈半悬浮状态，骨髓中残留的巨噬细胞前体虽然可贴附于

35、细胞培养板，但不再会对已形成，呈半悬浮状态，骨髓中残留的巨噬细胞前体虽然可贴附于细胞培养板，但不再会对DC的成熟起到抑制作用，反而会因为其贴于板底而使悬液中的的成熟起到抑制作用，反而会因为其贴于板底而使悬液中的DC的纯度更高。的纯度更高。3.3 加 入 重 组 小 鼠 GM-CSF(100U/ml，相 当 于 PeproTech 的 10ng/ml)和TNF-(500U/ml)，或重组小鼠GM-CSF(100U/ml，相当于PeproTech的10ng/ml)和 LPS(1g/ml)；3.4 37，5%CO2培养箱继续培养 1-2 天。【BMDC 的鉴定】的鉴定】1.形态学观察：BMDC 多数

36、呈集落生长，细胞有多个树突样突起，成熟的 BMDC 更加明显；2.细胞表型分析：流式细胞术检测 DC 细胞表面 CD11c，CD40，CD80，CD86，MHC II 类分子(I-A/I-E)等的表达，BMDC 高表达这些分子，完全成熟的 BMDC 中这些分子的表达会进一步提高。3.混合淋巴细胞反应(MLR)：BMDC 具有较强的刺激能力，且成熟度越高，刺激能力越强。摘自文献 Lutz MB,et al.J Immunol Metods.1999;223(1):77-92 8 美国美国 PeproTech(派普泰克派普泰克)中国代表处中国代表处 江苏省苏州市玉山路 99 号钻石广场 2 幢 4

37、16 室邮编：215021 电话：0512 6832 5983，6832 5993在线咨询：8000 53055(企业 QQ)邮箱：网址： 9【注意事项】【注意事项】1.小鼠品系和性别：小鼠品系和性别：多数研究表明，所使用的小鼠品系与获得 BMDC 的数量和成熟度关系不大9，但也有研究表明 C57BL/6 小鼠可能更好。Lutz 表示从 C57BL/10，DBA/2，C3H/J 和 129 等小鼠品系均可获得足够数量和纯度的 BMDC，但 Lutz 在其实验中更倾向于使用 C57BL/6，ICR 和 BALB/c 小鼠，且发现 C57BL/6 小鼠的 BMDC 产量最高，而且 ICR 小鼠和

38、C57BL/6 小鼠的 BMDC 对 LPS的成熟诱导敏感度高于 BALB/c 小鼠8。关于小鼠的性别，Inaba 认为雄性小鼠更好些，因为他们的骨骼更大，从而可以获得更多的前体细胞10，但多数学者更倾向于使用雌性小鼠。因此，目前培养 BMDC 用的比较多的小鼠是雌性或雄性 C57BL/6 小鼠。2.单独使用单独使用 GM-CSF 还是联合使用还是联合使用 IL-4?Inaba 经典法和 Lutz 大量制备法中均仅用 GM-CSF 即可诱导出相当数量的 BMDC，而且也在混合淋巴细胞反应中表现出较强的刺激作用，但其实这些 BMDC 的成熟度并不足够高。研究显示，GM-CSF+IL-4 联合诱导

39、比 GM-CSF 单独诱导产生的 BMDC 表达更高的MHC II 类分子和共刺激分子 CD80 和 CD86 等，提示前者具有更强的抗原递呈能力，而且前者在混合淋巴细胞反应中表现出更有效的刺激能力5,7。在动物实验中也发现，GM-CSF+IL-4 联合诱导的 BMDC 可产生保护性抗肿瘤免疫反应，而 GM-CSF 单独诱导的 BMDC 的保护性较弱6，这些都说明 GM-CSF+IL-4 联合诱导的 BMDC 的成熟度高于 GM-CSF 单独诱导的 BMDC。德国明斯特大学(University of Munster)的 Labeur 研究也表明，单独用 GM-CSF 诱导的 BMDC 为未成

40、熟 DC，GM-CSF 和 IL-4 联合诱导产生的 BMDC 的成熟度居中，添加 CD40L 或 LPS 可进一步诱导 BMDC 完全成熟7。因此笔者认为，要想获得功能更好的 BMDC，最好用 GM-CSF 和 IL-4 联合诱导骨髓细胞。而且，如果能在 Inaba 经典法和 Lutz 大量制备法中添加 IL-4，应该会获得更加成熟、有效的 BMDC。3.成熟诱导剂的选择成熟诱导剂的选择 LPS，CD40L 和 TNF-无论对人 DC 还是小鼠 DC 均是常用、有效的成熟诱导剂，那么应该选择哪个呢？TNF-a 诱导 DC 的成熟能力在三者中最弱7,8。LPS 和 CD40L 均是 DC 体外

41、完全成熟的强诱导剂，两者诱导 DC 的成熟度相似，但诱导产生的细胞因子谱有差异。CD40L诱导成熟的 BMDC 在体内显示出最强的免疫调节能力，包括保护性和治疗性肿瘤免疫 美国美国 PeproTech(派普泰克派普泰克)中国代表处中国代表处 江苏省苏州市玉山路 99 号钻石广场 2 幢 416 室邮编：215021 电话：0512 6832 5983，6832 5993在线咨询：8000 53055(企业 QQ)邮箱：网址： 10反应的产生7。用 LPS 刺激 DC 完全成熟所用的浓度一般为 1-10g/ml，但其实 0.1 g/ml 已经有非常强的作用，但保险起见，一般选用 1g/ml。对于

42、 CD40L 需要注意的是，CD40L 分子属于 TNF 配体家族，该家族的特点是在形成三聚体后才能发挥作用。所以最好能用重组的 CD40L 三聚体蛋白来刺激 DC，这样会有很好的效果。如果用 CD40L 单体来刺激 DC，多数情况下成熟度并不是很高。4.培养方法的选择培养方法的选择 本文列出迄今为止最常用的三种 BMDC 培养方法，我们从下表中可以更清楚地看出这三种方法的异同，相信您能根据您的需要作出正确的判断。参数参数 Inaba 法法 Lutz 法法 Son 法法 创立年份1992 年31999 年82002 年9在 PubMed 中被引用次数(截至 2015 年 12 月)783663

43、24骨髓溶血是否是骨髓先去除淋巴细胞是否否培养过程中去除粒细胞是否否骨髓细胞最初铺板密度0.51x106个/ml2x105个/ml2x105个/ml骨髓细胞最初铺板体积1ml10ml5ml培养器具性质24 孔细胞培养板100mm 细菌培养皿6 孔细胞培养板培养液RPMI1640+10%FCSGMCSF 浓度全程 2001000U/ml开始为 200U/ml 第 10 天后 30100U/ml开始为 125U1000U/ml，第 4天和第 7 天，向培养体系中再添加足量的 GMCSF 和 IL4IL4 浓度不用不用用，用法同 GMCSF换液方法第2天和第4天吸弃50%75%的旧培养液(其中含有细

44、胞)，然后换含足量 GMCSF 的新鲜完全培养液第 3 天补充等体积含 GMCSF的完全培养液；第 6，8 和 10天半量换液，吸出的旧培养液(其中含细胞)离心后用含GMCSF 的新鲜完全培养液重悬后放回未提是否换液。如换液，也应是吸出旧培养液(含细胞)，离心后用新鲜培养液重悬后放回。传代前培养时间(扩增)6 天10 天7 天传代后培养时间(成熟)2 天12 天无完全成熟诱导剂TNF(250U/ml)TNF(500U/ml)或LPS(1g/ml)LPS(110g/ml)DC 收获时间78 天1012 天78 天DC 纯度第 8 天：6070%第 1012 天：8090%第 7 天：8595%(

45、经甲泛葡胺梯度离心后)DC 产量/小鼠57x10613x10834x107注：注：1.该表是从文献8修改和添加而来；2.这里的 Inaba 法指的是其原法2，而不是本文中的改良法。美国美国 PeproTech(派普泰克派普泰克)中国代表处中国代表处 江苏省苏州市玉山路 99 号钻石广场 2 幢 416 室邮编：215021 电话：0512 6832 5983，6832 5993在线咨询：8000 53055(企业 QQ)邮箱：网址： 11【BMDC 培养试剂推荐】培养试剂推荐】生产商生产商 产品名称产品名称 产品编号产品编号 产品规格产品规格 使用浓度使用浓度 PeproTech 重组小鼠 G

46、M-CSF 315-03 5g/20g/50g/100g/250g/500g/1mg25-50ng/mlPeproTech 重组小鼠 IL-4 214-14 5g/20g/50g/100g/250g/500g/1mg10-40ng/mlPeproTech 重组小鼠 TNF-315-01A 5g/20g/50g/100g/250g/500g/1mg25-50ng/mlPeproTech 重组小鼠 sCD40L 315-15 5g/25g/100g/250g/500g/1mg1g/ml【BMDC 鉴定试剂推荐】鉴定试剂推荐】生产商生产商 产品名称产品名称 产品编号产品编号 克隆号克隆号 荧光标记荧

47、光标记 产品规格产品规格 PeproTech(BioGems)抗小鼠 CD11c 荧光标记抗体 03212 N418 FITC/PE/APC/PerCP-Cy5.5/APC-Cy7/PE-Cy7 25g/100g/500g抗小鼠 CD40 荧光标记抗体 02512 HM40-3 FITC 50g/100g/500g/1000g抗小鼠 CD80 荧光标记抗体 02912 16-10A1 FITC/PE/APC 25g/100g/500g抗小鼠 CD86 荧光标记抗体 08912 GL-1 FITC/PE/APC/PE-Cy7 25g/100g/500g抗小鼠MHC II类分子(I-A/I-E)荧

48、光标记抗体 86212 M5/114.15.2FITC/PE/APC/PE-Cy7 25g/100g/200g/500g注：注：用于 DC 鉴定的表面标志物的表达在流式图上均呈现单个峰，且多数情况下不能与阴性峰完全区分开来。为避免多色分析时补偿调节不好导致结果的不准确性，建议最好用单标，最多用双标来做 DC 表面标志的分析，而且必须使用同型对照，而非空白细胞对照来排除背景染色。【参考文献】【参考文献】1 Steinman RM,Cohn ZA.Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice.I.

49、Morphology,quantitation,tissue distribution.J.Exp.Med.1973;137(5):114262.2 Inaba K,Steinman RM,et.al.Identification of proliferating dendritic cell precursors in mouse blood.J.Exp.Med.1992;175(5):1157-67.3 Inaba K,Inaba M,et.al.Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cu

50、ltures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor.J.Exp.Med.1992;176(6):1693-702.4 Romani N,Gruner S,et.al.Proliferating dendritic cell progenitors in human blood.J.Exp.Med.1994;180(1):83-93.5 Zorina T,Mayordomo JI,et.al.Culture of dendritic cells from murine bone marrow supp