樱花的组织培养技术研究.doc

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1、目 录摘要1关键词11 前言21.1 樱花21.1.1 简介21.1.2 形态特征21.1.3生态习性21.1.4 品种21.2 植物组织培养21.2.1简介21.2.2 发展简史21.2.3应用前景21.3观赏类樱花的研究进展31.3.1 樱花的应用现状31.3.2 樱花的组织培养技术研究进展31.4 本研究目的和意义32 材料与方法42.1 材料42.1.1 样品42.1.2 实验药品42.1.3 实验设备42.1.4 培养基（MS培养基）配制42.2 实验方法42.2.1 外植体的选取与初步处理42.2.2 消毒42.2.3 接种42.2.4 统计方法43 结果与分析53.1 不同浓度2

2、,4-D对樱花叶柄愈伤存活率的影响53.2 不同浓度2,4-D对樱花叶柄愈伤诱导率和出愈率的影响53.3不同浓度6-BA对樱花叶柄愈伤存活率的影响63.4不同浓度6-BA对樱花叶柄愈伤诱导率和出愈率的影响64 讨论75 结论7参考文献7致谢8附录9樱花的组织培养技术研究摘要：分别在2,4-D和6-BA两种激素诱导下，对日本晚樱叶柄进行组织培养，得到了最适合樱花叶柄诱导愈伤组织的激素浓度，结果表明，在MS培养基中添加0.50.75mg/L2,4-D或0.751.0mg/L6-BA最适合樱花叶柄诱导愈伤组织。关键词：日本晚樱；愈伤组织；存活率；诱导率Study on Tissue Culture

3、Tcchnique of Cerasus SerrulataAbstract: The favorite hormone concentration matching for leading to the callus of the Cerasus Serrulat was studied by doing the experiments of tissue culture. the results showed the extent of the favorite hormone concentration matching for leading to the callus of the

4、Cerasus Serrulat were 2,4-D between 0.5mg/L and 0.75mg/L or 6-BA between 0.75mg/L and 1.0mg/L in the MS media.Keywords: Cerasus Serrulata; callus; survival; induction rate1 前言1.1 樱花1.1.1 简介 原产北半球温带喜马拉雅山地区，包括日本、印度北部、中国长江流域、台湾、朝鲜。在世界各地都有栽培，以日本樱花最为著名，共有200多个品种。因此，日本被誉称“樱花之国”。樱花的生命很短暂，一朵樱花从开放到凋谢大约为7天，整棵

5、樱树从开花到全谢大约16天，形成樱花边开边落的特点。1.1.2 形态特征 落叶乔木，树皮暗褐色，平滑；小枝幼时有毛。叶卵状椭圆形至倒卵形，长5-12cm，叶端急渐尖，叶基圆形至广楔形，叶缘有细尖重锯齿，叶背脉上及叶柄有柔毛。花白色至淡粉红色，径23cm，常为单瓣，微香；萼筒管状，有毛；花梗长约2cm，有短柔毛；3-6朵排成短总状花序。核果，近球形，黑色。1.1.3生态习性 樱花性喜阳光，喜温暖湿润的气候环境，对土壤的要求不严，以深厚肥沃的砂质壤土生长最好，根系浅，对烟尘、有害气体及海潮风的抵抗力均较弱。不耐盐碱土。根系较浅，忌积水低洼地。有一定的耐寒和耐旱力，但对烟及风抗力弱，是早春开花的著名

6、观赏花木。1.1.4 品种 主要是日本樱花和山樱，常见的栽培种类：日本晚樱，日本早樱、大山樱、云南樱花、科樱花、山樱花、毛樱花、重瓣红樱花、瑰丽樱花、垂枝樱花。1.2 植物组织培养1.2.1 简介 植物组织培养指从植物体分离出符合需要的组织、器官或细胞，原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。 植物组织培养概念（狭义）指用植物各部分组织，如形成层、薄壁组织、叶肉组织、胚乳等进行培养获得再生植株，也指在培养过程中从各器官上产生愈伤组织的培养，愈伤组织再经过再分化形成再生植物。1.2.2 发展简史 植物组织培养与细胞培养开始于19世

7、纪后半叶，1839年Schwann提出细胞有机体的每一个生活细胞在适宜的外部环境条件下都有独立发育的潜能。1853年Trecul利用离体的茎段和根段进行培养获得了愈伤组织，1901年Morgan首次提出一个全能性细胞应具有发育出一个完整植株的能力。Haberlandt(1902)首次提出细胞培养的概念，也是第一个用人工培养基对分离的植物细胞进行培养的人。1934年White用离体的番茄根建立了第一个活跃生长的无性系，使根的离体培养实验首次获得了真正的成功，并首次发现和提出B族维生素B1、维生素B6和烟酸的重要性。1944年，Skoog报道DNA的降解产物腺嘌呤和腺苷可以促进愈伤组织的生长，解除

8、生长素对芽形成的抑制作用，诱导芽的形成。1948年，Caplin和Steward用实验证明椰乳与2,4-D配合，对培养的胡萝卜和马铃薯组织的增殖起到明显的促进作用。20世纪60年代，在植物组织培养方面的另外两项成就就是划分小孢子培养和原生质体培养的成功。1.2.3应用前景 组织培养技术的主要应用：由于组织培养法繁殖植物的明显特点是快速繁殖，每年可以数以百万倍速度繁殖，因此对一些繁殖系数低，不能用种子繁殖的名特优植物品种的繁殖，尤为意义重大。脱毒，植物中有很多都带有病毒，严重影响植物的产量和品质，给农业带来灾害。特别是无性繁殖植物，如马铃薯、草莓、大蒜、康乃馨等，由于病毒是通过维管束传导的，因此

9、利用这些植物营养器官繁殖，就会把病毒带到新的植物个体上而发生病害。植物种质资源的保存、挽救濒于灭绝的植物。通过花药和花粉培养获得单倍体植株、缩短育种年限。胚胎培养的应用。细胞融合，通过原生质体融合，可部分克服有性杂交不亲和性，而获得体细胞杂种，从而创造新种货育成优良品种。培养细胞突变体的应用。用于遗传学、分子生物学、细胞生物学、组织学、胚胎学、基因工程、生物工程等。利用组织培养的材料作为植物生物反应器。用于其它未知科学的研究，现代科学发展非常迅速，很多现在预想不到的事情都有可能发生，新发明、新发现、新创造层出不穷，今天认为不可能的东西明天就可能变成现实。1.3观赏类樱花的研究进展1.3.1 樱

10、花的应用现状 纵观全球，种植樱花最普遍的当推日本，从平安时代起，日本的樱花便取代梅花而被奉为国花，经江户及明志大正时代大量栽培和培育，现在日本已形成了大观赏价值的大量樱花品种群，全国各地普遍种植1,2,3。此外，他们在其它理论和实用方面如品种的形成及亲缘关系，生态学方面等的研究也大大促进了樱花应用的深度和广度4。在欧美，园艺家们对樱花的运用更为广泛，发掘驯化了许多种类，这些种类中既有高大的乔木，又有稠密的灌木，既有落叶的，又有常绿的，从而为营造植物景观提供了更丰富的材料，如桂樱类常绿小乔木或灌木，园艺家们多将其修剪成球型或作地被种植，极好地弥补了一般樱花落叶后的单调景观5,6。自19世纪中国的

11、樱花引入英国伦敦以来，至今欧洲及北美的一些植物园、大学校园和很多公园都栽植了多种樱花，如英国的皇家植物园、德国的天姆树木园、美国外务部及哈佛大学校园等。近年来，我国各地区樱花栽培相继开展，一些城市如武汉、南京、无锡、苏州、青岛和北京等地已形成一定的规模和特色，当然，还有我们科大的樱花园。1.3.2 樱花的组织培养技术研究进展 樱属植物的种子在自然的条件下不易发芽，Suzaka研究认为，大多数樱属种子属于深休眠种子，需要针对休眠的类型进行处理7。近年来，我国也有许多研究人员对樱花进行了相关研究，1992年，沈惠娟先生在木本植物组织培养技术中对部分食用樱桃类的组织培养研究作了小结，并列出了部分研究

12、者摸索出的分化和生根培养基配方及外植体再生方式。之后，相继有人对樱桃和甜樱桃的组织培养进行试验。1994年周志坚等人报道了有关大岛樱组培试验结果8；1998年及华对山樱花进行了离体快速繁殖试验，用不同配方的培养基对不同阶段进行了处理，得到了较好的生根组合9；2001年徐兆波等报道了对垂枝樱花的繁育技术的研究结果10；2002年王光萍等报道了福建山樱花的组织培养及植株再生技术的研究结果11；2004年姚连芳等报道了樱花组培快繁生产技术的研究结果12；2004年周丽华等做了排寒樱组织培养快繁研究的报道13；2006年闰道良等做了钟花樱组织培养再生体系建立的报道14；2006年孟月娥等做了日本晚樱组

13、培快繁技术研究的报道15。随着现代生物技术发展，体细胞胚胎发生将成为一种快速繁殖苗木的方法，有着很广阔的前景。1.4 本研究目的和意义 本研究对日本晚樱嫩叶叶柄进行愈伤组织诱导实验，并且对激素浓度进行筛选，记录实验结果，并分析各种激素浓度下的存活率、诱导率和出愈率，以研究激素浓度对樱花嫩叶叶诱导愈伤组织的影响。2 材料与方法2.1 材料2.1.1 样品 以湖南科技大学樱花园中日本晚樱的叶柄为材料2.1.2 实验药品 95%酒精、2,4-D、6-BA、Na-OH、KNO3、NH4NO3、MgSO47H2O、KH2PO4、CaCl2 、MnSO4H2O、ZnSO47H2O、H3BO3、KI、NaM

14、oO42H2O、CuSO45H2O、CoCl26H2O 、Na2-EDTA、FeSO47H2O、甘氨酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆素、烟酸、肌醇、蔗糖、琼脂粉、升汞。2.1.3 实验设备 超净工作台、高压灭菌锅、电子天平、普通冰箱、烘箱、光照培养箱、电炉、培养架、紫外线杀菌灯、冰箱、蒸馏水器、弯剪、解剖刀、接种盘、组培瓶、烧杯、量筒、移液管、试剂瓶、移液管架、容量瓶、试管、酒精、玻璃棒、滴瓶等。2.1.4 培养基（MS培养基）配制 母液配置：母液分大量元素、微量元素、铁盐、及有机物质四类（附录表4）。配制母液同时要配制1mg/mL的2,4-D和6-BA，首先分别准确称取各物质50mg，再用2mL95

15、乙醇和2mL1mol/L的NaOH或HCl分别去溶解，然后加水定容至50mL，浓度为1mg/mL，放在冰箱内(4C)备用。其次，培养基分装，可分三步：第一步，取1000mL烧杯一只，首先加500mL蒸馏水，然后加大量元素10倍母液100mL，微量元素100倍母液10mL，铁盐100倍母液10mL，有机物质100倍母液10mL，蔗糖20克，待蔗糖充分溶解后，加水定容至100mL。再按实验目的附加不同浓度的NAA、2,4-D 、6-BA，用1mol/L的NaOH或HCl调酸碱度PH=5.8，最后加入琼脂粉6.5g。第二步，把含不同激素配比的培养基的烧杯放在微波炉内加热，直到琼脂完全融化(6min)

16、，拿出冷却后，分装到培养用的三角瓶中，每只100mL三角瓶约装40mL培养基。(分装时要避免把培养基倒在瓶口上，否则培养时容易引起杂菌污染。)第三步，把牛皮纸裁成适当大小的长方形，背靠背折起来，折成正方形，紧密裹在瓶口上并系好，随后便可进行湿热灭菌（高温121灭菌20分钟）。灭菌后培养基冷却，凝固使用。2.2 实验方法2.2.1 外植体的选取与初步处理 把从樱花植株上取下来的嫩叶枝条带回实验室后用自来水冲洗干净，用刀片下叶柄，投入300ml 的烧杯中，自来水冲洗15min，移置超净工作台进行消毒和接种处理。2.2.2 消毒 用70%酒精灭菌2030s，立即用无菌水冲洗3次，用0.1%HgCl2

17、灭菌68min，无菌水冲洗5次。2.2.3 接种 点燃酒精灯，打开三角瓶，依次接入不同浓度激素的培养基中，每瓶3株。标明培养材料，培养基代号，接种日期和接种人。3天后开始观察，并统计结果。2.2.4 统计方法 存活率=存活数/接种数100%诱导率=愈伤组织数/接种数100%出愈率=愈伤组织数/存活数100%表1 各培养基的激素浓度 （单位：mg/L）培养基编号 2，4-D 培养基编号 6-BAM1M2M3M40.25 M5 0.250.5 M6 0.50.75 M7 0.751.0 M8 1.0 M9 2.03 结果与分析3.1 不同浓度2,4-D对樱花叶柄愈伤存活率的影响试验结果如表2所示，

18、当2,4-D激素浓度为0.25mg/L时，组织存活率较低，只有26.7%；而在2,4-D激素浓度在0.50.75mg/L时，组织存活率有59.0%60.0%；2,4-D激素浓度为1.0mg/L时，组织存活率为57.5%，这说明在2,4-D激素浓度在0.50.75mg/L时，最适合组织生长。表2 不同浓度2,4-D的愈伤组织培养状况培养基编号 接种数 存活数 愈伤数 存活率 诱导率 出愈率M1 60 16 12 26.7% 20.0%M2 45 27 20 60.0% 44.4%M3 39 23 17 59.0% 43.6%M4 40 21 12 57.5% 30.0%75.0%74.1%73.

19、9%57.1%表3 不同浓度6-BA的愈伤组织培养状况培养基编号 接种数 存活数 愈伤数 存活率 诱导率 出愈率M5 45 12 10 26.7% 22.2% 83.3% M6 57 16 13 28.1% 22.8% 81.3% M7 42 23 16 54.8% 38.1% 69.6% M8 42 20 18 47.6% 42.9% 90.0% M9 42 13 13 31.0% 31.0% 100.0%3.2 不同浓度2,4-D对樱花叶柄愈伤诱导率和出愈率的影响实验结果显示，当2,4-D激素浓度为0.25mg/L时，组织诱导率比较低，只有20.0%，而2,4-D激素浓度分别为0.5mg/

20、L、0.75mg/L、1.0mg/L时，组织诱导率分别为：44.4%、43.6%、30.0%；2,4-D激素浓度分别为0.25mg/L 、0.5mg/L、0.75mg/L、1.0mg/L时，组织出愈率分别为：75.0%、74.1%、73.9%、57.1%；综合两者分析得出，2,4-D浓度为0.50.75mg/L时，最适合诱导愈伤组织。3.3不同浓度6-BA对樱花叶柄愈伤存活率的影响在实验结果中，我们发现，6-BA浓度分别为0.25mg/L、0.5mg/L、0.75mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L时,组织存活率分别为26.7%、28.1%、54.8%、47.6%、31.0%。说明6-BA

21、浓度为0.75mg/L时，最适合组织生长。 图片1 M1号培养基愈伤组织生长状况 图片2 M3号培养基愈伤组织生长状况 图片3 M5号培养基愈伤组织生长状况 图片4 M7号培养基愈伤组织生长状况 图片5 M8号培养基愈伤组织生长状况 图片5 M9号培养基愈伤组织生长状况3.4不同浓度6-BA对樱花叶柄愈伤诱导率和出愈率的影响从实验数据（表3）中，可以比较直观的看出，6-BA浓度分别为0.25mg/L、0.5mg/L、0.75mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L时，组织诱导率分别为22.2%、22.8%、38.1%、42.9%、31.0%；组织出愈率分别为83.3%、81.3%、69.9%、

22、90.0%、100.0%。说明6-BA的浓度为1.0mg/L时，最适合诱导愈伤组织。4 讨论2,4-D是一种主要的除草剂，曾作为用于研究微生物降解氯化芳香化合物的模型化合物。也是一种人工合成的植物激素生长素, 也可用作植物生长调节。实验结果表明，在培养基中添加0.50.75mg/L2,4-D时，樱花叶柄易于诱导愈伤组织，诱导率可达44.4%，而出愈率，也有74%。6-BA是细胞分裂素类植物激素，它主要影响细胞分裂、顶端优势的变化和茎芽的分化，结果表明，在培养基中添加0.751.0mg/L6-BA时，樱花叶柄容易诱导愈伤组织，诱导率可达43%，出愈率可达90%。结果表明，组织的存活率较低，出愈率

23、表现异常，这与琼脂、pH 、操作和培养条件有关。实验材料琼脂条不易溶解，pH出现偏高或偏低，导致培养基的硬度不均或过硬，另外由于实验时间较长，培养的温度不均，操作、材料、消毒环节，都可能染菌和褐变，都对组织存活率和出愈率有一定影响。在试验过程中，外植体常出现褐变现象，一般认为，这是由于多酚氧化酶（PPO）被氧化成醌类物质，并抑制许多酶的活性，从而影响植物材料的生长，严重时导致培养物死亡。在樱花叶柄组织培养中，也有少量的褐变现象发生。实验过程中，污菌比较常见，可能的原因有：外植体消毒不彻底。在外植体消毒过程中，由于消毒时间过短或是其某些部位不易灭菌，使之染菌。植物组织中普遍存在内生菌。接种过程中

24、的污染。这与工作台或实验器具灭菌不彻底有关，因此，在实验前，灭菌操作一定要细心，灭菌过程要彻底。培养基灭菌不彻底。培养基灭菌后，应在无菌室中放置34天，如未发现染菌，即可使用。5 结论 本研究历时两个多月，是我对之前所学知识的深入探索。根据结果与分析，研究得出在培养基中添加0.751.0mg/L的6-BA或者添加0.50.75mg/L的2,4-D最适合樱花叶柄诱导愈伤组织。参考文献1冯怀宇.樱花-日本人心灵的故乡J.少年科技博览，2003(2):8-9.2王相飞.中日“樱花”意象比较研究J.范大学文学院学报，2007(2):112-118.3朱荣根，赵瑞云.日本人与樱花J.知识就是力量，200

25、1(4):32.4张晋岩日.留住那场樱花雨-日本樱花面面观J.中国花卉盆景，2003(5):25-26.5Byun O.Park.H.S, lee.S.K. effect of position of explants on rooting rate and rot development of Prunus serrulataJ. Research Report of the Forest Genetics Research Institute,1995.58(31)：106-111.6Baranova M.Principles of comparative stomatographic s

26、tudies of flowering plantsJ.Botanical Review,1992.58(1);49-92.7段晓梅，樱花繁殖综述J.思茅师范高等专科学校学报，2002(3):82-85.8周志坚，张慧民.大岛樱的组织培养与繁殖J.广东林业科技,1994(1):16.9及华.樱花的离体快速繁殖J.植物生理学通讯，1998(4):269.10徐兆波，郭绍霞.垂枝樱花引种观察与繁育技术研究J.莱阳农学院学报，2001(1):32-36.11王光萍，黄敏仁.福建山樱花的组织培养及植株再生J.南京林业太学学报，2002(2):73-75.12姚连芳，张建伟，冷天波等.樱花组培快繁生产技

27、术J.农业科技通讯，2004(2):23.13周丽华，王振师.排寒樱的组织培养快繁研究J.广东林业科技，2004(4):1-4.14闰道良，王贤荣，钦佩等.钟花樱组织培养再生体系的建立J.林业科技开发，2006(3):21-24.15孟月娥，李艳敏，赵秀山等.日本晚樱组培快繁技术研究J.中国农学通报，2006(10):264-266.致谢本文的研究工作和论文撰写承蒙白宁宁老师的悉心指导，实验过程得到李玉峰老师、梁芳老师、潘文杰、王淋、罗辉、黄明燕、周倩等同学的大力支持和帮助，在此表示诚挚的谢意。感谢我的室友，感谢她们在生活学习上对我的关心和帮助，在我人生的这一段宝贵经历中留下了很多的欢声笑语，

28、为我营造了一个充满着欢乐和温情的学习生活环境。最后，感谢所有关心和爱护我的亲人、朋友、老师和同学们。附录表4 MS培养基母液配制（单位：mg）类别成 分规定量称取量母液体积（mL）扩大倍数配1升的吸取量（mL）大量元素KNO3NH4NO3MgSO47H2OKH2PO4CaCl219001650370170332.2519001650370170332.25100010100微量元素MnSO4H2OZnSO47H2OH3BO3KINaMoO42H2OCuSO45H2OCoCl26H2O16.98.66.20.830.250.0250.025169086062083252.52.510010010铁盐Na2-EDTAFeSO47H2O37.2527.853725278510001005有机物质甘氨酸盐酸硫胺素盐酸吡哆素烟酸肌醇2.00.40.50.51001002025255000500100110