光电检测读书笔记.docx

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1、单粒子多通道的生物气溶胶荧光传感器一、研究背景过去的十年，环境可以被连续监测到存在潜在的有害生物气溶胶,在这些搜寻方法中，颗粒荧光方法已经得到了相当的关注。当包含生物有机体的主要生物荧光基团被射线激活时，内部粒子荧光可以用来帮助区分生物与非生物粒子，甚至可以提供生物颗粒间的差别，这些粒子是环境中的正常成分，而且可能会被认为是一种威胁。然而，由于来自生物荧光基团的荧光通常很微弱，在空气中的生物荧光基团数量很少，所以激活射线必须很强烈，而且激光器必须以这个目的来使用。比如在早前的系统中，多采用连续波激光器，尽管这些激光器体积大易碎，而且只针对重要的生物荧光基团的有效激发下产生的较长波长起作用，像色

2、氨酸，最优应激出现在260280nm波长范围内。因此，大量用于谐波分析的固体激光器获得广泛认可，比如四倍频的Nd-YAG激光器，同时拥有266nm的输出波长和比连续波气体激光器更小的波形因数。二、激光激发荧光系统（LIF）这些发现已经开始发掘LIF对于描述空气粒子和病原体的潜力。然而，固体调谐激光器各组成部分相对昂贵，系统中还要求多点检测和大范围追踪。因此，目前要在结构小巧和能量大并且能连续发出低于300 nm波长的半导体光源发展上做很大的努力。特别是开始于2002年的美国SUVOS（半导体紫外光源）计划，正在这个目标上有巨大收获，已经证实原始LED装置能够在毫瓦功率级发射280nm室温连续波

3、。这些装置已经在生物传感器试验台进行了组装。过去的十年中，从现有已开发的粒子LIF系统公布的结果看，针对令人满意的繁衍和典型的个体生物粒子LIF记录，允许一个“荧光测定和捕获”的近似下限。这表明，一般情况下，粒子必须经过能量密度大于200-300J/cm2紫外激光照射，在获得的信号中，粒子每个球面度的荧光角能采集到足够的信噪比。在要求光谱信息具有高分辨率的场合下，能量密度必须按比例增加；例如，潘永乐 8 介绍了一种具有超过100个记录通道的荧光光谱仪，该种光谱仪所用的紫外激光能量密度为3104J/cm2。就如同在毫秒级的时间内从Q调制固体激光器，或者像紫外发光二极管这样的连续波低功率源作用一样

4、，我们要求紫外激光能量在几十纳秒的时间内传送给粒子。然而，在后一种情况，长时间保持聚焦的紫外线照射单一粒子存在问题（难度），而且这也违背整体气溶胶样品体积流量的原理。因此，尽管紫外发光二极管和极紫外二极管激光器为实际生物气溶胶荧光传感器提供了较好的前景，但在它们可以被纳入商业领域的检测系统之前，设备的输出功率和寿命必须增加。直到这种设备经常使用，替代低成本高功率的紫外光源满足需求才不那么迫切，才能满足以荧光为基础的生物气溶胶传感器在军事和民用场景的需求。微型氙闪光灯代表这样的更替，它有传递紫外激光能量到粒子的能力，并且作为宽带光源，它还为用于生物荧光最佳激发波长提供了选择。本文介绍了一种紧凑的

5、低成本的原型气溶胶荧光传感器，采用两个这样的氙闪光灯记录两通道荧光数据，这两道荧光来自大小为1m单个空气粒子，粒子速度可达7500个/分钟。三、单颗粒气溶胶荧光传感器，WIBS2这个系统原型是在双氙气宽光源生物传感器基础上描述的。双氙气宽光源生物传感器记录了许多来自体积在几个立方厘米的大样本中的粒子荧光辐射，它利用了光学过滤的氙气光源的周期性闪烁。像这样，同时多粒子照明大大简化了机械气流系统和光学检测系统，使整体传感器的成本非常低。但是，多个粒子同时激励会不可避免地导致荧光数据平均结果超过所有的粒子，虽然这对大致均匀的气溶胶无太大影响，但它损害了传感器区分低浓度有害生物粒子对较高浓度的背景颗粒

6、的能力。单个粒子的检测需要避免此类情况。1、WIBS2的运行概况新型单粒子荧光传感器WIBS2采用一个中心光学腔，腔周围设有一个用于检测和分选颗粒（见2.4节）的660nm连续波长二极管激光器，两个在不同波段（见2.3节）发射脉冲的氙气紫外线光源，和两个荧光检测通道FL1和FL2（这两个通道用于两个波段的粒子的荧光检测）。因此，对每一个粒子来说，其大小的估计都用一个2x2的激发发射矩阵记录。连续激光束气溶胶流散射体荧光辐射捕捉图1 WIBS2传感器的示意图和传感器实体，约（26x22x28）厘米大小在操作中，气溶胶是从周围的气体通过层流输送系统引入的。当粒子在中心腔从二极管激光器穿过聚焦光束时

7、，层流输送系统使悬浮颗粒基本上成单层排列。气溶胶总流量为4.5升/分钟，在注入新气溶胶流前，其中一部分以3.9升/分钟缓缓通过，形成一个鞘流限制剩余样品流过。气溶胶样品流和激光束的交叉点确定散射体（直径0.8mm和深度130m），如图1所示。进入激光束的粒子会产生散射光信号，从散射信号的量级，粒子（球形物）尺寸可由Mie理论确定。图2 氙气光脉冲叠加在散射体上的横截面（虚线椭圆）图2显示了散射体（虚线椭圆），从氙气光源1看：以30角向下观察水平面，粒子检测之后照射10s（对粒度进行评估所需的时间），此时粒子已经移动了 180m到达水平面，也就是散射体的下面。XE1输出是有目的的，最高能量密度区

8、域包括被黑色椭圆划定的粒子目标区。第二个氙气光源XE2随后照射6s，以低于第一个光源的速度保证这段时间内额外粒子的运动。交叉点处的粒子目标区域，从每个氙灯发出的紫外辐射脉冲约2mm1mm的面面积（见图2），以基本均匀的超过300J/cm2的能量照亮整个散射体。因此，不管粒子从哪儿穿过这个区域，当比较不同粒子的荧光性质时，应当考虑经过类似的紫外应激的影响（6%之内）。WIBS2采用两个滨松L9455氙模块（日本滨松光子学株式会社）。这些都是紧凑型（1043.5cm）外部触发模块，模块中包括一个精度为1.5毫米弧长的氙气放电管。闪光能量的再生性能在3%是较好的（虽然在WIBS2中每个放电管都进行了

9、测量和对变化的校正）。氙源以最大放电能量40 MJ和闪光持续时间1s进行工作。在最大闪光能量下工作时，氙最高重复频率为126 Hz，限制它的散热功率为5W。以其目前0.6L/min的采样流量，WIBS2能够对粒子浓度高1.310L 的粒子激发荧光。超了这个浓度，额外的颗粒只能被计数和测量。氙灯输出随脉冲次数缓慢下降，在1.5109脉冲后下降到75%，相当于在126Hz的最大放电率下连续运行3000小时。2、荧光采集由两氙紫外脉冲激发的粒子固有荧光发射通过检测通道FL1和FL2收集。每个通道包括直径51mm的光阑、焦距为17.5 mm的球面镜，反映了荧光灯发出粒子穿过腔室到一个完全相同的相对反射

10、镜的孔中，如图3 ZEMAX射线所示。因此，每个镜子能收集荧光发出超过3.1 sr的立体角，并通过一个带通滤波器引导粒子到达小型光电倍增管（PMT）模块的光电阴极。这个系统的设计是这样的：PMT的视场被限制在一个直径2mm的小圆圈内，它包括散射体和散射体正下方的粒子目标区域。这减少了光电倍增管接收多余的荧粒子。图3 一种荧光检测通道（如虚线所示的第二通道反射镜）的射线图3、荧光激发和发射带第一个氙灯的输出使用了自定义的紫外带通滤波器进行光学滤波。280nm峰值波长（如图4）激发的结果和色氨酸生物荧光基团的吸收峰很符合。第二个氙灯使用了自带的现成的滤波器进行滤波，产生一个370nm的峰值（如图4

11、），很接近另一种重要生物荧光基团的最大吸收峰。第一个荧光检测通道FL1，要求检测正好与色氨酸的荧光光谱最大值重合的荧光，即：大约在300-420nm之间，峰值在345nm处。一个在330nm处具有50%的透射率的自定义长通光学滤波器最初就是为了这个目的开发使用的。当结合光电倍增管的光电阴极响应时，检测带可从320nm延伸至600 nm，如图5所示。图4 wibs2氙气光源的光谱输出XE1和XE2第二个检测通道FL2，针对的是NADH的发射带，即：在400-600 nm之间，峰值在450 nm。这个波段的定义是使用一个标准的KV418滤波器实现的，这个高通滤波器具有尖锐的截止波长和极低的内荧光效

12、率。再次，该滤波器的透射率和光电倍增管光电阴极的有效结合定义了所需的带宽，如图5。虽然FL1带宽远远超出主色氨酸在420 nm的发射峰的上限，但这种传输和包括大多数的色氨酸辐射的FL2通道之间是不同的。（注意，尽管在本文中用过滤器记录了实验数据，但一个新的在310nm具有50%的透过率的长通滤波器不久将取代FL1通道中的DUV2长通滤波器。这将在有效捕捉短波长的色氨酸荧光发射峰的改进上提高40%）。图5 FL1（左）和FL2（右）荧光检测。在每一种情况下，虚线表示PMT检测器的响应，短划线表示滤波器，和实线表示产生的荧光带4、粒子探测正如上面提到的，当一个粒子进入散射体后，通过从连续波二极管激

13、光束发出的光弹性散射，粒子可以被探测到。为了方便和进一步降低传感器成本，这种散射光检测也由FL2通道实现了荧光检测。如图5显示，用于FL2通道的光电倍增管检测器有一个迅速下降到600 nm波长的响应。在660nm波长的激光器中，PMT响应是波长400nm时峰值下降一千倍的一个因素。很偶然的情况下，粒子弹性散射的幅度也是类似于粒子荧光的一个因素，这使得弹性散射和FL2荧光脉冲必须使用相同的PMT增益设置才能成功记录。通过这种方式测出的粒子尺寸只是近似的，因为被FL2探测器接收到的散射光幅度是粒子形状、折射率以及大小的函数。5、数据采集获取颗粒尺寸和荧光数据这样的周期大约需要25秒。图6显示当一个

14、直径3m的聚苯乙烯乳胶球通过散射体时，从检测器通道FL1和FL2信号的示波器波形。当颗粒进入激光束时，FL2通道（靠上的轨迹）记录的是弹性散射信号的幅度，编号为（1），为负向信号。由于FL1通道增益设置低于FL2，但在一个较小的幅度，FL1的轨迹也检测到这种散射光信号。 图6 由于3 m大的 PSL球体通过散射体后，FL1和FL2检测器信号的一个例子（见文本说明编号）粒子探测后10s，XE1氙灯开始照射，用280 nm的紫外线辐射粒子，产生荧光信号（2）和（3），分别从通道FL2和FL1获得。这个过程之后6s，XE2氙灯开始照射，用370 nm波长的紫外辐射照射的粒子。通道FL2记录波长带宽在

15、420-600 nm的粒子发出的信号（4）。但是，氙灯2的辐射范围位于通道FL1的带宽之内，因此本通道光电倍增管（PMT）可接收到弹性散射粒子。波长370 nm辐射产生的弹性散射幅度远远高于其产生荧光信号幅度，而且足以使FL1通道检测放大器在顷刻间达到饱和。这种饱和信号脉冲（5）不可用。从饱和恢复到放大状态需要10s。信号（1）、（2）、（3）、（4）在被传递到主机处理器之前，集中综合他们的宽度，数字化综合值精度达到12位。该系统现在已经准备好探测更深层的粒子。然而，由于氙气光源需要约5ms重新充电，在这5ms的时间内经过散射体的任何颗粒可以记录测量，但没有获得荧光数据。6、数据处理每个粒子的

16、荧光数据记录必须作下列修正：（1）、背景补偿：被FL1和FL2检测到的信号补偿由散射腔中紫外线激发的低能量荧光和阻带滤波中很小的有限透射比产生的滤波突破引起。在散射体中无粒子无样品流动条件下，当氙灯1和氙灯2被迫发光时，这些偏移量的大小取决于测量的FL1和FL2通道响应。（2）、紫外脉冲能量的微小变化和长期衰减。从采用紫外敏感的光电二极管的XE1和XE2记录每个紫外脉冲幅度。（3）、荧光过滤（筛选）。FL1和FL2通道的光滤波器被粒子和荧光灯产生的弹性散射紫外线轰击。对于足够高的幅度的散射紫外线，能产生荧光过滤器可检测的电位。通过记录石英或氯化钠这样非荧光颗粒产生的清晰荧光，来校正这种效应。以

17、下数据已根据上述误差来源进行更正。四、初步实验数据表1 WIBS2数据分析记录将表1罗列的三种荧光度量法和粒子尺寸、粒子数密度结合起来，就有很多潜在的方法。虽然下面简单的图形显示了一些信息，但其他基础方法，比如人工神经网络分析，更适合自动化决策，而且对于DSTL，我们的合著者也在努力。图7显示了一些常见的荧光和非荧光材料的各种测试气溶胶的结果，材料的选择有助于实现WIBS2粒子鉴别。在100L的镇流器箱内使用TSI三引擎喷气机气溶胶发生器将聚苯乙烯乳胶球样品雾化并抽取样品。用被过滤的压缩空气设备将干粉材料：纸桑花粉、石膏纤维、水垢（CaCO3）纤维和生粉在镇流器箱制成喷雾。将奎宁水（浓度为1%

18、专用奎宁水）直接喷到镇流器箱。在图片7中，X轴的尺寸是任意单位。尽管从0.5m扩展到了10m，但对于在2.4中提到的诸多因素，我们在将记录粒子散射信号转换为一个球形当量粒径的初始数据中也并没有没做修正。详细的建模和实验测试正在做，以确定测量颗粒形状和折射率的灵敏度。Y轴“FL2Xe2”的荧光信号也是任意单位。Z轴“FL1Xe1/FL2Xe1” 是一个无量纲的量，主要表示颗粒材料的功能，反映了粒子荧光辐射的光谱分布，而不是它的幅值。如果通道FL1和FL2光电倍增管获得的信号相等，那么FL1Xe1/FL2Xe1的值几乎总是超过一（见图5的透过率曲线）。但对于很多材料来说，带宽在300nm-400n

19、m之间的荧光辐射比超过400nm时的要严重，因此为了使动态范围最大化，FL1通道的光电倍增管增益设置要比FL2通道的低一个数量级。图片7 WIBS2测试气体溶胶初始数据的影像图片7和相关的QuickTime影视文件显示：大多情况下，鉴别不同类型气溶胶很容易实现。1m聚苯乙烯乳胶球的分布比3m和5m同种材料的变体要宽，是这些最小粒子散射和荧光信号中较低信噪比的结果。同样地，在FL1Xe1和FL2Xe1的比值范围内，由于石膏和水垢分子极低的荧光或信噪比能产生很大的变化，所以它们分子的量级分布相对广泛。果然，浓度1%的奎宁水滴和掺杂1.7m的乳胶球荧光颗粒产生很高的荧光值，特别是在被FL2通道覆盖的

20、420-600nm带宽之间。图8显示的是更具代表性的生物材料和种类的气溶胶，未来的生物气溶胶传感器需要将它们检测到，在理想情况下还能识别它们。DSTL记录的数据显示：从气溶胶结果：水洗过的BG孢子；干燥分散不能发育的BG孢子；水洗过和没水洗的大肠杆菌营养细胞；0.1mmol色氨酸和NADH溶解液；1%卵清蛋白水溶液；3m的乳胶球。为作参考，和1%的奎宁水和1.7的荧光乳胶球有关的数据借用图7的数据。除干燥的BG孢子用过滤后的压缩空气雾化外，每一种材料都是从悬浮液雾化的。所有气溶胶都在一个装有循环风机的大密闭容器内产生，在这个容器内，样品被吸到WIBS2传感器。并行采样的气溶胶空气动力学粒径谱仪

21、（TSI APS 3300）提供有关气溶胶浓度数据和平均粒径。图8中的数据显示不同粒子类型之间预期的差别。值得注意的是：（1）、尽管水洗过的和干燥的BG孢子有不同的材料特性，但是两者的分布较为一致。由APS记录的水洗孢子的平均粒子尺寸为1.1m，干燥分散孢子呈现出较大的粒子平均尺寸，大约为1.5m，有5m尾部延伸出来，说明有的孢子聚集的发生；（2）、水洗过和没水洗的大肠杆菌营养细胞在1-2m的范围内表现出不同的分布。水洗的大肠杆菌细胞比BG孢子在FL1Xe1和FL2Xe1比值较高的位置出现得多，建议对于大肠杆菌细胞在320-420nm范围内增加一个荧光数量级。没水洗细胞的FL1Xe1/FL2X

22、e1的值较低，而在FL2Xe2轴上的值很高，细胞中剩余生长介质引起荧光波长增长。（3）、一些气溶胶比如大肠杆菌粒子和无水洗BG孢子，它们的数据分布说明了尺寸变大时FL2Xe2变大、FL1Xe1/FL2Xe1减小的一致性。假设这是由与短波长荧光被较大粒子吸收引起的，但是还需要进一步研究。（4）、卵清蛋白和色氨酸的分布在FL1Xe1/FL2Xe1高值处基本重合， 在300-450nm之间，它们有相似的强荧光特性。图8 WIBS2测试的多种生物与非生物气体溶胶初始数据的影像五、装置及结果讨论双氙气WIBS2系统原型已经证明了它鉴别尺寸在1m左右生物和非生物气溶胶粒子的潜力。虽然只要能实现设备长寿命和

23、输出功率，半导体紫外发光二极管和激光二极管的紫外光源就可提供最佳的粒子荧光激发方案，但使用这里描述的精密的氙气紫外线光源，也能满足目前低成本领域生物气溶胶检测的民用和军事需求。进一步要改进的是：将最大粒子的分析速度提高到500粒子/s，样品的流速增加至1L/min，正如下文讨论的，尽可能进一步缩短检测低浓度生物气溶胶的响应时间。目前的传感器配置，氙灯源对含有激光束的平面成30（如图1）。这提供了机械的简便性，但是也意味着在外脉冲的交叉区域必须，以保证粒子靶区，也就是散射体下方区域被均匀照亮。机械设计的传感器将氙源和激光束放置到到同一水平面上，用氙灯看到的粒子靶区交叉区域减少成一层很薄的尺寸为0.80.1mm的水平带，也就是散射体下方的区域。这使得氙光更紧密聚焦在垂直方向上，同时保持在整个目标区域均匀辐射。由于紫外射线被限制在一个很小的交叉区域，氙灯总的脉冲能量被降低了4倍，同时在靶区仍然可以达到所要求的300J/m2的能量密度。这样较低的脉冲能量要求在脉冲重复率为500/s和分析粒子荧光时有相应提高。更进一步，在垂直方向上，氙灯输出聚焦导致在能量密度超过300J/m2的水平区域宽度略微增加。这足以让气溶胶样品流的直径从0.8mm增加到1mm，同时样品体积流量从0.6L/min增加到1L/min。氙灯寿命不会因为较高的脉冲重复率受到过分损害，因为氙灯寿命和脉冲能量也成反比。