植物叶绿素的提取及分析研究(毕业论文doc).doc

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1、题目：植物生长过程叶绿素含量的分析与研究任务内容（包括内容、计划、时间安排、完成工作量与水平具体要求）本文的研究方法主要以实验为基础，运用丙酮和乙醇的1:1混合法提取测定叶绿素，对提取的叶绿素进行分光光度法，在进行数据对比和图像观察时应用计算机,借助于这些软件工具，对叶绿素的成分结构进行分析。具体时间安排：12月18日12月30日 学习叶绿素提取及分光光度法的相关知识。 1月2日1月 6日 阅相关资料，确定论文提纲及相关论证内容。1月9日2月26日 撰写开题报告提纲及相关论证内容2月27日3月5日： 查阅论文资料3月6日3月12日： 广泛搜索相关资料，初步了解相关内容3月13日3月19日： 筛

2、选资料，选出密切相关的资料3月20日3月26日： 有针对性地阅读相关专业的书籍3月27日4月20日： 补充阅读过程中遇到的或遗漏的知识点4月21日5月7日： 进行论文的初步起稿做相关的实验和数据图像处理5月8日5月28日： 论文基本定稿5月29日6月4日： 在老师的帮助下认真修改论文6月5日6月11日： 充分做好论文答辩的准备6月12日6月17日： 进行论文答辩其中：参考文献篇数： 20篇以上（其中外文文献3篇）图 纸 张 数： 说明书字数： 论 文 字 数： 8000字左右 外文翻译： 专业负责人意见签名：年 月 日植物叶绿素的提取及分析研究摘 要采用直接浸提法用丙酮与乙醇的1：1提取液对绿

3、色植物叶绿素进行提取,并利用Arnon公式测定叶绿素的含量。绿色植物叶绿素含量与光合作用及氮素营养有密切关系，对绿色植物进行研究，叶绿素含量是重要指标，其定量测定是植物生理研究中必做的实验之一，对叶绿体结构的分析研究也是重要的手段，所以树木叶片叶绿素测定结果对决定树种的分布、科学育种及植物病理等研究具有指导意义。本文分别从提取手段、提取溶剂和实验条件等几个方面综述了树木叶片叶绿素的提取用不同有机溶剂提取效果不同的机理；比较了不同树种叶片叶绿素含量的差别。使用浸提、紫外光谱分析和荧光分析等手段，对不同溶剂提取测定树木叶片叶绿素的能力进行了对比分析，并对提取的叶绿素利用荧光显微镜进行观察,分析叶绿

4、体的结构。结果表明，用不同提取溶剂提取叶绿素，提取液吸收光谱相似。其中丙酮与乙醇等体积混合浸提法提取叶绿素效果最好，叶绿素得率最高；华北卫矛叶片的叶绿素含量比其它树木叶片高，并且叶绿素b含量高于叶绿素a。关键词：叶绿素；叶绿素含量变化；浸提法Extraction of Plant Chlorophyll and Research on Fluorescence AnalysisAbstractThe plant chlorophyll is extracted with various extracted liquid by adopting soaking method.And the co

5、ntent of chlorophyll is measuresed using Arnon formula.The content of plant chlorophyll is related to photo-synthesises closely.Researching on plants, the content of chlorophyll is an important index.Its metered measurement is the one of necessary experiments in the physiological research.It is an i

6、mportant means for analyzing the structure of chloroplast.So the measured result of chlorophyll has the leading significance on studying on istributing trees,cultivating scientifically and plant pathology etc.The text summarizes the different impact on mechanism,that chlorophyll for extraction with

7、different organic solvents.Its description manifests several aspects,such as extraction method, extraction solvents and experiment condition and so on.It compares the differences on the content of chlorophyll in the different species.Using soaking and fluorescence analysis methods,the text carrys on

8、 the contrast analysis to different solvents for extraction capacity of the plant chlorophyll.Extracted chlorophyll is observed with fluorescence microscope in order to analyze the structure of chloroplast.As a result, absorption spectrum of extracted liquid is alike by extracting chlorophyll with d

9、ifferent different solvents.Among them,the method of acetone and ethanol mixed with the same cubage has the best effect.The chlorophyll that it extracts is the most.The The content of chlorophyll of Hua Bei Wei Maos leaves are higher than others.And the content of chlorophyll a is higher than chloro

10、phyll bs.Key words: chlorophyll; Fluorescence Analysis; soaking method目 录摘要Abstract1绪论 51.1对叶绿素提取及测定方法研究的重要性 51.2叶绿体的形态结构 51.3叶绿素的构成 62 提取及测定方法72.1.1 直接浸泡提取法72.1.2 研磨法82.1.3超声波提取法92.1.4国内学者对植物叶绿素提取的研究 92. 2 叶绿素的测定方法102.2.1测定方法的发展及趋势102.2.2 Arnon法及Arnon公式简介103 材料与实验113.1 实验材料113.1.2 溶剂的选择 113.1.3 仪器1

11、13.2 实验方法113.2.1树叶的处理113.2.2有机溶剂浸提法提取叶绿素 114 结果与计论134.1不同提取溶剂对叶绿素提取总量的影响134.2不同提取溶剂提取叶绿素的进程13 结论 13参考文献.附录致谢植物生长过程叶绿素含量分析与研究1 绪论1.1 对叶绿素提取及测定方法研究的重要性叶绿素是存在于植物细胞中的一类极重要的绿色色素，是绿色植物进行光合作用时吸收、转化和传递光能的主要物质。它是以一种色素蛋白复合体的形式存在于类囊体中，占植物鲜重的0.05%至0.20%，占干重的0.5%左右。目前，基木认同叶绿素在光化学反应中起着重要的作用，叶绿素a是利用日光能的主要色素，叶绿素b是辅

12、助色素。植物体内的叶绿素水平可以衡量光合能力。关于叶绿素与光合作用的关系因叶龄、叶绿素含量而表现出一定的差异性。叶绿素a/b值对光合作用也有一定的影响，叶片净光合速率与大于1的叶绿素a/b值呈负相关。叶绿素a含量决定总叶绿素含量水平，而叶绿素b含量主导叶绿素a/b值的变化、总叶绿素含量、叶绿素a含量与净光合速率。植物中的叶绿素含量，被广泛作为植物生长的常测指标，并与植物的光合作用、营养吸收等密切相关。叶绿素具有解热，止血等药理功效，在生物及药物研究中有重要作用.因此，叶绿素的提取、测定及其性质研究有着重要意义。叶绿素含量的测定一般有分光先度法、活体叶绿素仪法和光声光谱法，其中以分光光度法应用最

13、为广泛。叶绿素提取方法的研究最早的是1941年Mackinney提出的丙酮法和由Arnon解释和推导的Arnon法，80年代初，有人又提出了用丙酮乙醇混合液的提取法4。对于叶绿素的提取方法的研究，具有非常现实的意义，所以很多科研工作者对叶绿素的提取方法做了很多的研究和探讨。1.2 叶绿体叶片是进行光合作用的主要器官，而叶绿体是光合作用的重要细胞器。从绿藻到高等植物的绿色细胞都包含有叶绿体。叶绿体是从前质体发育而成的。通常，前质体是由未受精的卵细胞衍生而来的，经细胞与前质体的形成无关。当胚发育是前质体进行分裂；当叶片和茎形成是，前肢质体发育成叶绿体。幼叶绿体也能进行分裂，特别是含有幼叶绿体的器官

14、曝光时，分裂更迅速，所以每个成熟的也细胞通常含有几百个叶绿体。在光学显微镜下可以看到，高等植物的叶绿体大多呈椭圆形，一般直径为36m，厚约23m。据统计，每平方毫米的蓖麻叶就含有35107个叶绿体。这样叶绿体的总面积就比叶面积大的多，因而对太阳光能和CO2的吸收利用都有好处。下图是叶绿体的亚显微结构。每个叶绿体由被膜、基质和内膜组成。图1 叶绿体的微观结构叶绿体被膜分两层。外层厚65，是非特异离子扩散膜，低分子物质如无机盐、核苷酸和蔗糖等都可以较快的透过。而高分子物质如糊精就不能透过。内膜厚约85的类脂蛋白质组成的生物膜，对离子有地渗透性，所以对物质透过就有一定的限制。外膜和内膜之间有10nm

15、距离的电子半透明区。叶绿体基质电子密度较小，呈无定形的凝胶状，含有转换CO2成为碳水化合物特别是淀粉的酶系统。在电镜下还可见许多微粒结构，包括DNA纤丝、核糖体、淀粉粒和亲锇颗粒等。叶绿体DNA以双链超螺旋环的形式存在，在基质中进行转录和翻译作用。叶绿体片层膜系统是由基质类囊体与基粒类囊体相互连接而成的三维空间网状结构，贯穿在整个基质中，类囊体是由两层厚约7nm的膜组成的扁平囊，含有色素，以及内有一个腔，充满着水和溶于水的盐。通常由10100个类囊体垛叠成基粒。基粒的直径约为0.32m。组成基粒的类囊体称为基粒类囊体，也称基粒片层。一个基粒类囊体与另一个类囊体接触的区域称为紧贴区域，不与其他类

16、囊体接触的区域称为非紧贴区域。没有发生垛叠的类囊体称为基质类囊体，也称基质片层。基质类囊体是把一个基粒与另一个基粒相连接的长形类囊体，贯穿在整个基质中。它们经常延伸成为和构成一个或多个基粒的组分。这样基质类囊体与基粒类囊体就形成了一个三维空间网状结构。关于类囊体膜的结构，根据冰冻撕裂的研究和X-衍射的分析，可以认为类囊体膜并不是对称的。膜由脂质双分子层组成，其中埋藏着许多大小不同的蛋白质分子。不同植物或同一植物不同部位的叶绿体内基粒的类囊体数量不同。例如，烟草叶绿体的基粒有1015个类囊体，玉米则有1550个；同是冬小麦，基粒类囊体数目随叶位上升而增多，至旗叶达到高峰。叶绿体的含水量为7580

17、，其干物质中3050为蛋白质，2030为脂类物质(包括色素)，色素约占叶绿体干重的8。叶绿体片层膜中的脂类物质，除负责吸收光的色素外，重要的是糖脂，其次是磷脂和硫。1.3 叶绿体色素（1）叶绿体色素的化学特性叶绿体色素有三类：(1)叶绿素，主要包括叶绿素a和叶绿素b；(2)类胡萝卜素，其中有胡萝卜素和叶黄素；(3)藻色素。类囊体膜中含有叶绿素和类胡萝卜素，叶绿体被膜中只含有一些类胡萝卜素(特别是紫黄质，叶黄素的一种，不含叶绿素)。叶绿素中主要有叶绿素a和叶绿素b。叶绿素a的分子式为C55H72O5N4Mg，叶绿素b的分子式为C55H70O6N4Mg，其结构式见图。这两种色素差别很小，叶绿素a呈

18、蓝绿色，叶绿素b呈黄绿色。它们在结构上的差别，仅在于1个-CH3被1个-CHO所取代。叶绿素a和b都是卟啉化合物，即都是由4个吡咯环组成的1个大环。这个大环中有一整套共轭双键，也就是1个大键。在这个卟啉环中央有1个镁原子。镁与4个氮原的距离是相等的。叶绿素所以是绿色，主要就是由这个卟啉环中的电子和Mg所决定的。叶绿素a和b都是1个双羧酸的酯，1个羧基为甲基所酯化，另1个羧基为叶醇基所酯化。所以叶绿素可以发生皂化反应：叶绿素a和b中的卟啉环是亲水的，但其上所带的叶醇基的“尾巴”都是亲脂的。叶醇是1个由4个异戊二烯单位所组成的双萜，是1个亲脂的脂肪族链。这个“尾巴”的存在决定了叶绿素分子的脂溶性。

19、叶绿素分子中卟啉环的大小为(15)2，叶醇基长为20。卟啉环中的镁原子可为H+，Cu2+，Zn2+等离子所取代，当镁被铜或锌取代后，仍可保持绿色。绿色的新鲜植物标本的保存就是利用这一原理，即用醋酸铜溶液处理绿色的新鲜植物标本。叶绿素不溶于水，仅溶于酒精、丙酮、乙醚、乙烷等有机溶剂中。叶绿素a、b的结构图（2）绿色植物光合作用的作用光谱作用光谱是指不同波长的光所引起的光合作用的多少。如果以氧的释放作为光合作用强度的指标，那么作用光谱的测定就是要知道不同波长的光所能引起的氧释放的数量。下图描述了22种作物的作用光谱。作用光谱的测定有助于鉴定参与的色素，因为作用光谱常常和参与的色素的吸收光谱密切相关

20、。 2 提取及测定方法2. 1 叶绿素的提取方法总的来说，提取方法主要分直接浸泡提取法、研磨法和超声波提取法等三种。2.1.1 直接浸泡提取法 将样品直接放入有机溶剂中提取叶绿素，是最简单，目前应用最广泛的一种叶绿素的提取方法之一。使用不同的浸提剂，浸提时间、浸提温度以及浸提效率也各不相同。因此，如何选择溶剂在直接浸泡提取法中就显得非常重要。在浸提法中溶剂应该具有提取效率高、挥发性小、毒性低、价格不贵、易于获取等特点。目前使用过的溶剂主要有丙酮（Acetone）、甲醇（Methanol）、二甲基亚砜（DMSO）、N N-二甲基甲酰胺（DMF）、乙醇（Ethanol）等几种。因叶绿素浸提法受到重

21、视，陈福明、陈顺伟6和张宪政4分别对不同配比的丙酮、乙醇和水的混合液的浸提效果进行了研究，证明利用混合液进行叶绿素浸提的可行性。洪法水等研究表明，丙酮与乙醇混合液提取叶绿素存在协同效应，且两者在等浓度混合时提取效果最好。另外，彭运生、刘恩12和刘绚霞、董振生11等研究认为，丙酮乙醇（1：1）混合液浸提叶绿素效果较好。由于本试验拟采取丙酮与乙醇的1：1溶液提取叶绿素，下面主要对这两种溶剂进行介绍。(1)丙酮（Acetone） 1940年，Mackinney首先提出用丙酮作为提取剂，并得出了叶绿素a和叶绿素b的消光系数。（Mackinney.1940）；1949年，Arnon用80%的丙酮作为提取

22、液来提取菠菜苗叶绿素并进行分光光度法测定，他所使用的方法在国际上被广泛应用至今(Arnon.1949）。1952年，Richard等用丙酮将样品浸泡了9个小时得到叶绿素a. b和c(Richard et al., 1952)。 1960年、Vernon用80%丙酮作溶剂用分光光度法测定叶绿素a、叶绿素b和脱镁叶绿素a、脱镁叶绿素b，并得出了计算公式(Vernon,1960)。后来又经Humphrey和Wooton在1966年证实90%丙酮是提取海洋浮游植物中叶绿素的一种理想溶剂(Humphrey et al., 1966)。 1966年国际海洋研究科学委员会推荐使用将样品浸泡于90%丙酮中低温

23、过夜浸提的方法。Parsons等人和其后的许多人都是用90%丙酮提取色素(Parsonset a1.,1963; Parsons, 1984).1985年Inskeep等认为Arnon的研究结果有误，在80%丙酮中叶绿素a和b的最大吸收波长应分别为664.5和647nm，而且对等消光系数也进行了修正(Inskeep,1985)。丙酮和90%丙酮作溶剂，测定叶绿素a、b和c的光谱数据己为众人所知，Jeffery和Humphrey给出了计算叶绿素的光谱经验公式，并为后人所证实(Jeffery et al., 1975)。到目前为止，以90%丙酮为溶剂的方法仍然在广泛使用。 叶绿素的光学性质随溶剂中

24、水分的增加而改变。1960年Vernon将100%,90%和80%丙酮的叶绿素谱图进行比较，认为随着水分的增加，叶绿素a, b的最大吸收波长由小向大移动(叶绿素a从662移至665nm，叶绿素b从647移至 649nm )，而且含水分样品比脱水样品更易提取色素(Vernon, 1960)。1974年Jeffery建议先用100%丙酮提取叶绿素，进行光谱测定时再稀释成90%的丙酮。但是丙酮易挥发、易燃的性质仍是使用时需要考虑的问题(Jeffery, 1974)。(2)乙醇（Ethanol） 在迄今己知的色素提取溶剂中，乙醇是最安全的提取溶剂，但多数时间用于提取淡水浮游植物的色素提取，后来一些科学

25、家也将乙醇用于提取海洋浮游植物。2.1.2 研磨法 研磨法主要是通过研磨机械破碎植物细胞，使溶剂更易进入细胞提取色素。早期的研磨法是使用聚四氟乙烯小锤在玻璃的搅拌器中以500r.p.m的转速将植物细胞捣碎，让溶剂浸入。这种方法至今仍被广泛使用。但这种方法也有缺点，首先锤与搅拌器之间的距离直接影响提取结果，距离太小容易引起局部过热而且滤液不宜进入缝隙，提取效率低;其次转移过程不可避免会引起遗漏而使操作者直接接触溶剂。为避免溶剂遗漏可能带来的危险，操作者应注意保护眼睛和手，佩戴安全眼罩和手套。较常使用的研磨法还有人工在玛瑙研钵中研磨和在20r.p.s的玻璃珠搅拌器中研磨提取色素的方法。2.1.3

26、超声波提取法 超声波提取法主要是先通过超声波来破坏植物细胞，然后用溶剂提取色素。超声波在狭小的空间内可产生20,000个大气压的压力，并可产生穿越几个微米的震动波，产生的瞬间高温可达10，000K。1975年Alliger使用超声波在溶剂中形成破坏空穴使细胞破裂(Alliger, 1975)。研究者发现超声仪的探针传输功率为73.5W.，时效果不如研磨法，而当功率达到398 W.，时效果优于研磨法(Chang et al., 19$2; Wright et al., 1984)。如果总传输功率只有60 W，超声波很少能穿透置入超声仪中的样品容器外壁进入溶液(Sartory et al., 19

27、84)。研究证明传输功率大小很大程度上会影响提取时间的长短。使用大功率超声仪超声10分钟的操作会导致提取液温度上升和色素降解(Sartory et al., 1984)。虽然超声波法有一定的优势，但由于设计和几何学不同的超声仪提取色素效果不同，而且换算相当复杂，所以难以广泛应用。2.1.4国内学者对植物叶绿素提取的研究（1）洪法水对菠菜叶绿素提取的研究5方法：将从市场采购的菠菜洗净，除去叶脉，剪碎、混匀，称菠菜叶2g放入棕色试剂瓶中，加入60 ml 下列有机溶剂:丙酮，乙醇，甲醇，乙醚.n(丙酮):n(乙醇)=1:1混合液，浸泡至发白，用U V- V is测定光吸收，每隔24 h测1次，测5次

28、后，光吸收不再增加，计算叶绿素含量，并在350-700 nm光波段扫描吸收光谱.同时称菠菜叶2g按Arnon法用丙酮或乙醇研磨并定容至60 m1，过滤后测定光吸收，计算叶绿素含量.比较不同有机溶剂、直接浸提法和Arnon法提取叶绿素的效率. 结果:用n(丙酮):n(乙醇)=1:1的摩尔比混合浸提后.其萃取反应的平衡常数远大于丙酮、乙醇单独浸提的萃取反应平衡常数.因此用丙酮和乙醇混合浸提植物叶片叶绿素明显比丙酮、乙醇单独浸提的效率高. （2）李得孝对玉米叶绿素提取的研究7方法：按体积比配制提取液:80%丙酮，丙酮：乙醇（1：1），丙酮：乙醇：水（4.5：4.5：1），丙酮：甲醇（1：1），丙酮：

29、甲醇：水（4.5：4.5：1），分别用上述几种提取液浸提提取玉米叶绿素。 结果：在室温10摄氏度下浸提和冷冻处理后浸提，不同提取液表现同样的趋势:丙酮和乙醇（甲醇）混合液比同类含水的提取液要好，其中丙酮：乙醇为1:1的提取液提取叶绿素快而完全，丙酮：乙醇：水为4. 5 ：4. 5 ：1的提取液最慢，丙酮：甲醇：水为4. 5：4. 5 ：1的提取液提取较快但提取量最少。因此，采用丙酮：乙醇为l：1的提取液提取叶绿素的方法最好。（3）冯双华对水稻叶绿素提取的研究9方法：在水稻各生育时期自上而下取三片叶，用剪刀剪碎(长1 cm以下)，各处理分别称2g鲜重，放入带塞的三角瓶中，分别用95%乙醇和80%

30、丙酮作为浸提液，将浸提液小心倾入100 ml容量瓶中定容至100 m1摇匀后吸5 ml该液于50 ml容量瓶中用95%乙醇和80%丙酮分别定容至50 ml然后用分光光度计比色测定。结果：用95%乙醇作为浸提液，测得的叶绿素含量在所有处理中均比用80%丙酮作浸提液的高，其差值平均为0. 274士0. 204,平均高13. 10%，说明用95%乙醇浸提效果比80%丙酮的好。（4）于相丽对牡丹叶绿素提取的研究8方法：将新鲜的牡丹品种赵粉叶片洗净、用滤纸吸干，去大叶脉后剪碎混匀，称取0. 05g，放人比色管中，分别加人l0ml 丙酮；95%乙醇；80%丙酮；丙酮:95%乙醇1:1；丙酮:95%乙醇2:

31、1；丙酮：无水乙醇：蒸馏水4.5：4.5：1；丙酮:95%乙醇:蒸馏水4.5：4.5：1 ；80%乙醇提取液，定容。避光处浸取至预定时间，每一处理均重复3次. 结果：一种好的提取溶剂应该是提取速度快、叶绿素得率高、稳定性好且测定结果精密度高.，浸取8h提取液的提取效果并不是很理想，叶绿素含量普遍较低。其中以丙酮:95%乙醇=2:1提取液效果最好，达到1. 987mg/g.浸取16h, 80%乙醇提取液中得到最大提取量，达到2.0917 mg/g.浸取24h，叶绿素得率最大的为丙酮:95%乙醇2:1，达到2.9403 mg/g。丙酮:95%乙醇2:1为提取液，浸取24h为提取牡丹叶绿素的最佳方法

32、.叶绿素提取方法的研究报导不尽一致，加之叶绿素不稳定，见光易氧化分解，各种测定方法均有一定误差。对此有待进一步研究讨论。由于直接浸泡法操作简单且实验得出的效果比较好，我们采用直接浸泡法。经过多次的实验以及参考前人得出的结论，我们得出用丙酮和乙醇的2：1溶液提取叶绿素效果最好。2. 2 叶绿素的测定方法2.2.1 测定方法的发展及趋势 1941年Mackinney直接以80%丙酮为溶剂用分光光度法定量测定了叶绿素a和b(Mackinney, 1941)。1942年Comar以乙醚作溶剂用分光光度法分别测定了叶绿素a和b(Comar, 1942)。1955年Smith和Benitez分光光度法测定

33、叶绿素a和b，同时还可以测定其它叶绿素和其衍生物(Smith et al., 1955 )。1952年Richard和Thompson首次将分光光度法用于海洋学的多色素的同时分析（Richard et al., 1952)。1963年Parson和Strickland认为Richard和Thompson的结果有许多矛盾之处，并对叶绿素和类胡萝卜素的计算公式进行了修订（Parson et al., 1963)。由于此法操作方便、准确度高、可同时测定多种色素、便于处理大量样品等优点，至今分光光度法还被广泛应用。何之常等用乙醇和丙酮提取水稻叶绿素，张宪政等用丙酮和无水乙醇1:1混合液提取小麦叶绿素，

34、刘绚霞提出了用丙酮和乙醇的2:1混合法提取测定油菜叶绿素。随着高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography)在色谱分离方面的发展，尤其是反相色谱的发展，使高效液相色谱在20世纪80年代得到快速发展(Mantoura,l983; Wright;1984; Roy, 1987)，从此时起叶绿素就可以不受其降解产物影响进行准确的定量分析。 最近又有基于光声效应的光声光谱法测定植物叶绿素(陈秉初等，1993)。其原理是样品吸收了强度经调制的入射能量，通过无辐射方式将吸收的能量转变成热能，热能以热波形式在样品和周围气体中转变成声能，形成光信号。通过光信号的强

35、弱和入射能量，就可测定叶绿素的含量。研究人员以刺槐的叶片为样品用光声光谱法和Arnon法测定叶绿素，结果表明Arnon法测的叶绿素a和b的含量分别于647nm和426nm处的光声信号强度具有明显的相关性。但由于光声光谱与乙醚中的叶绿素吸收谱相比有红移现象，光合放氧对光声信号有影响，色素干扰等问题，此法没有得到广泛应用，有待进一步研究。2.2.2 Arnon法（分光光度法）及Arnon公式简介 分光光度法：利用分光光度计测定叶绿素提取液在最大吸收波长下的吸光值，即可用朗伯比尔定律计算出提取液中各色素的含量。叶绿素a 和叶绿素b 在645nm 和663nm 处有最大吸收，且两吸收曲线相交于652n

36、m 处。因此测定提取液在645nm、663nm、波长下的吸光值，并根据经验公式可分别计算出叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素的含量。 Arnon 公式为: 叶绿素a浓度(mg/l ): Ca =12.7A 663一2.69A 645叶绿素b浓度(mg/l ): Cb =22.9A 645一4.68A 663叶绿素总浓度(mg/1 ): C = Ca + Cb3 材料与实验3. 1 实验材料3.1.1植物叶片的选择 实验根据我校现有的树木以及实验提取研究的方便，选择丁香、白桦、华北卫矛、柳、紫椴等五种常见树种，从叶子开始发芽时采集。本次试验各品种树叶于2007年5月1日至21日采自东北林业大学校园，采

37、集后带回实验室处理。3.1.2 溶剂的选择所用提取溶剂的选择依据以下原则：(1)溶剂的性质：溶剂能与水和其它有机溶剂混溶。溶剂挥发性小，毒性小。溶剂易于获取，价格便宜。(2)不改变叶绿素的结构叶绿素结构式中有酯键，避免选用强酸强碱性溶剂，以免破坏酯键，改变叶绿素的结构。(3) 易于穿透细胞壁叶绿素在海藻细胞结构中位于细胞质的叶绿体中，细胞壁内层是纤维素，外层是果胶质或藻胶质。所选溶剂最好能溶解或破坏细胞壁，使叶绿素溶出，而且不改变叶绿素的结构和性质。(4) 排除水分的干扰采用直接浸提法提取叶绿素，树叶在前处理时不能把水分完全去除，所以选用溶剂应能与水相混溶，消除因水分引起溶液浊度增加而使背景吸

38、光值增加，干扰实验结果。根据以上原则，可以选择丙酮和乙醇，本实验采用丙酮和乙醇的1：1溶剂提取叶绿素。 3.1.3 实验仪器TUspc紫外可见分光光度计TG 528B 阻尼分析天平（分度值 0.4mg）3. 2 实验方法3.2.1 树叶的处理 将采取的不同树种的样品，用自来水冲洗干净，再用双蒸水冲洗三遍。用吸水纸吸干叶体表面水分,按不同种类的树叶分别放入密封塑料袋中,然后放入低温冰箱冷藏保存待用。3.2.2有机溶剂浸泡法提取叶绿素具体步骤：（1） 分别取三种不同的树叶：丁香；华北卫矛；柳树。将叶片洗净，擦干，去掉中脉剪碎，每种采若干片树叶，分别测其重量。配制丙酮：乙醇体积比为1：的溶液，将三种

39、剪碎的树叶分别放入100ml的小广口瓶中，分别加入25ml丙酮与乙醇1：提取液，振荡，用报纸遮光包好后放在避光处提取(要至少浸泡八个小时).（2）对（1）的分光光度计扫描的结果进行分析,应用分光光度计的软件具体操作为:扫描结束后,打开视图-读图谱工具,分别于波长为645nm和663nm处读取吸光度数值,叶绿素含量测定方法为:分别以提取溶剂作空白，测定叶绿素提取液吸光度A 645 , A 663，利用Arnon公式:叶绿素a浓度(mg/l ): Ca =12.7A 663一2.69A 645;叶绿素b浓度(mg/l): Cb =22.9A 645一4.68A 663;叶绿素总浓度(mg/1):

40、C = Ca + Cb（3）重复以上的实验步骤，分别进行三实验，最后可得以下的表格，此表揭示了这三种植物在不同的生长过程当中其叶绿素含量的变化以及叶绿素在整个叶片的含量；表中叶片质量的单位为：g，叶绿素的单位为：mg，叶片浓度的单位为：mg/g。 时间种类第一天第四天第十天第十四天第二十天 柳 树叶片质量0.66800.27500.61600.79130.9486叶绿素a0.11850.11231.11851.20171.3116叶绿素b0.04630.03940.54311.19890.9309总叶绿素0.16480.15171.66162.40062.2424叶绿素浓度0.24670.55

41、162.69743.03372.3639 丁 香叶片质量0.35291.40332.50362.09291.5832叶绿素a0.23331.27541.22011.21851.2500叶绿素b0.08031.54452.01441.99271.7554总叶绿素0.31362.81993.23453.21123.0054叶绿素浓度0.88862.00951.29191.53431.8983华北卫矛叶片质量0.20100.64300.98000.97981.2756叶绿素a0.14750.88730.83140.83110.8299叶绿素b0.05370.83731.36961.36821.379

42、1总叶绿素0.20221.72462.20102.19932.2090叶绿素浓度1.00602.68212.24592.24461.7317实验一：从本次实验中，我们可以看到随着叶子的生长，叶片当中的叶绿素a、b的含量都在逐渐的增加，柳树在整个过程中叶绿素a的含量一直大于叶绿素b的含量，而华北卫矛和丁香在初期是叶绿素a大于叶绿素b，但到后期却相反。实验二： 时间种类第一天第四天第十天第十四天第二十天 柳 树叶片质量0.39550.22480.37420.37480.7355叶绿素a0.20140.23430.38610.56820.6580叶绿素b0.12210.07960.12880.223

43、30.5090总叶绿素0.32350.31390.51490.79151.1670叶绿素浓度0.81801.39641.37602.11181.5868 丁 香叶片质量0.21640.43840.94202.46503.1891叶绿素a0.09040.45890.64830.61580.6129叶绿素b0.03240.37220.69501.06241.0580总叶绿素0.12280.83111.34331.67821.6709叶绿素浓度0.56751.89581.42600.68080.5239华北卫矛叶片质量0.10040.21170.70201.64182.2087叶绿素a0.10170.25750.66010.61690.6071叶绿素b0.03700.08860.52680.98041.0432总叶绿素0.1